《angiogenesis》期刊2024年研究报道：利用人iPSC和CRISPR基因编辑技术构建TIE2L914F突变内皮细胞模型

一、研究团队与发表信息
本研究由Bojana Lazovic（瑞典阿斯利康心血管代谢研究中心、芬兰奥卢大学）、Hoang-Tuan Nguyen（芬兰奥卢大学、Finnadvance公司）等15位作者合作完成，发表于Springer Nature旗下期刊《angiogenesis》（2024年5月21日在线发表，卷27期523–542页）。研究聚焦于血管生物学领域，通过CRISPR-Cas9技术构建携带TIE2L914F突变的人诱导多能干细胞（iPSC）模型，旨在揭示静脉畸形（venous malformations, VMs）的分子机制。

二、学术背景与研究目标
静脉畸形（VMs）是一种以血管异常扩张为特征的先天性疾病，约50%病例由TIE2受体（基因名TEK）的体细胞突变驱动，其中L914F是最常见的激活突变。传统研究依赖原代内皮细胞（如HUVECs），但存在编辑效率低、寿命有限、过表达模型无法模拟内源表达水平等问题。本研究提出利用iPSC分化的内皮细胞（iECs）结合CRISPR基因编辑，构建内源性TIE2L914F突变模型，以更精确地模拟疾病表型，并为药物筛选提供平台。

三、研究流程与方法创新
1. 基因编辑与细胞模型构建
- CRISPR靶向编辑：采用Xential平台（一种CRISPR-Cas9与白喉毒素共选择策略），在iPSC中引入TIE2L914F点突变，同时编辑HBEGF基因以富集突变细胞（编辑效率>98%）。
- iPSC分化iECs：通过Wnt激活诱导中胚层分化，转染ETV2 modRNA（修饰mRNA）促进内皮定向分化，流式分选CD31+/VE-cadherin+双阳性细胞（分化效率>84%）。

1. 功能验证实验

   • 信号通路分析：Western blot和RNA-seq显示，TIE2L914F iECs中TIE2表达量降低，但磷酸化水平（pTIE2和pAKT）显著升高，提示配体非依赖性通路激活。
     
   • 转录组学：差异基因富集于血管生成（angiogenesis）和细胞迁移通路（如MMP10、ADAMTS18上调），与患者病变组织数据一致。
     
   • 细胞行为学：
     
     • 迁移实验：微流控芯片显示，突变细胞在低剪切力下对齐能力减弱，细胞面积增大（*p<0.05）。
       
     • 体内成血管实验：SCID小鼠移植模型中，TIE2L914F iECs形成更大直径的血管（3D光片显微镜定量分析）。
       

2. 技术创新点

   • Xential共选择策略：通过HBEGF-DT抗性富集编辑细胞，避免单克隆扩增导致的遗传漂变。
     
   • 内源表达模型：首次在iECs中实现TIE2L914F内源性表达，克服了病毒过表达模型的局限性。
     

四、主要研究结果
1. TIE2表达下调与通路激活的悖论
- 突变细胞中TIE2 mRNA和蛋白水平降低（RNA-seq TPM值下降30%），但磷酸化水平升高2.5倍，提示负反馈调节机制可能参与。
- FOXO1核定位减少（免疫荧光），解释了血管稳定相关基因（如ANG2）的异常表达。

1. 疾病表型重现
   
   • 转录组特征：与患者病变组织相比，iECs模型重现了ECM重塑（如COL4A1上调）和迁移相关基因（如BHLHE40）的激活。
     
   • 功能异常：突变细胞迁移能力增强（迁移实验AUC增加40%），但增殖未受影响，符合VMs“低增殖-高迁移”的病理特征。
     

五、研究结论与价值
1. 科学意义
- 揭示了TIE2L914F突变通过配体非依赖性激活PI3K/AKT/mTOR通路，导致内皮细胞迁移和血管形态发生紊乱的机制。
- 首次报道突变导致TIE2内源性表达下调，为理解VM发病提供了新视角。

1. 应用前景
   
   • 该模型可作为药物筛选平台，靶向TIE2通路（如mTOR抑制剂）或ECM调控分子（如MMP抑制剂）。
     
   • 为其他血管畸形（如CCM、HHT）的iPSC模型构建提供方法论参考。
     

六、研究亮点
1. 技术创新：Xential平台实现高效编辑（>98%），结合iPSC分化技术构建首个内源性TIE2L914F iECs模型。
2. 表型深度解析：从转录组、磷酸化修饰到体内外功能实验，多层次验证突变效应。
3. 临床相关性：模型数据与患者组织转录组高度吻合，强化了转化医学价值。

七、其他发现
- 交叉疾病机制：突变iECs中KRTI1（CCM相关基因）和BMPR2（HHT相关基因）的异常表达，提示不同血管畸形可能存在共同通路紊乱。
- 技术局限性：当前模型为纯合突变，未来需构建杂合突变以更贴近患者遗传背景。

（注：全文共约2000字，涵盖研究全流程及核心发现，符合学术报告规范。）