本研究由意大利技术研究院（Istituto Italiano di Tecnologia）的Martina Trevisani、Alessandro Berselli、Giulio Alberini、Valentina Castagnola、Luca Maragliano、Fabio Benfenati等学者，联合热那亚大学、巴里大学、马尔凯理工大学等多家研究机构共同完成，于2025年1月10日发表在期刊 Science Advances 上。
研究背景与目的
血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）是维持大脑内环境稳态的关键结构，但同时也阻碍了绝大多数药物进入脑实质，这严重制约了神经退行性疾病、脑肿瘤及遗传性脑病的药物治疗。血脑屏障的旁细胞途径（paracellular route）由紧密连接（tight junctions, TJs）严格控制，而紧密连接的主干蛋白是密蛋白家族（claudin family）。其中，claudin5（CLDN5）在脑内皮细胞中表达量最高，是限制离子和小分子旁细胞通透的核心蛋白。因此，开发能够瞬时、可逆地调控CLDN5功能的分子工具，对于改善脑部药物递送具有重要的转化医学价值。
此前已有研究尝试利用CLDN5胞外环（extracellular loops, ECL）衍生肽或产气荚膜梭菌肠毒素C端结构域（cCPE）衍生肽来调节紧密连接，但这些肽链长度较长（超过30个氨基酸，某些cCPE衍生物长达170个氨基酸），在合成、溶解度、构象稳定性及临床转化方面存在困难。本研究旨在通过计算模拟与体外实验相结合的多学科策略，设计并筛选链长小于20个氨基酸的短肽，以寻找能够高效、特异性结合CLDN5并瞬时增强血脑屏障通透性的候选分子。
研究工作流程与方法
研究首先基于人CLDN5（hCLDN5）的多聚体结构模型，包括基于小鼠CLDN15模板构建的三孔结构以及基于背靠背（back-to-back）界面的模型，对CLDN5在紧密连接链中的顺式（cis-）和反式（trans-）相互作用界面进行了分析。从先前报道的c5c2肽和cCPE蛋白中截取多个长度不超过16个氨基酸的短片段，并在部分序列中引入单点突变以改善水溶性，构建了一个候选肽数据库。
随后，研究者采用全原子分子动力学（molecular dynamics, MD）模拟，在模拟Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）离子强度的水环境中评估了各候选肽的聚集行为和溶剂化程度，并结合机器学习方法对肽的溶解度进行分类预测。实验验证则使用液相色谱-质谱联用（liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS）定量测定了代表性肽在纯水和DMEM中的实际浓度。
对于筛选出的可溶性肽，研究者进一步采用分子对接和200纳秒标准MD模拟，考察其与小鼠CLDN5（mCLDN5）蛋白胞外域的相互作用稳定性。为量化结合自由能，研究者使用温度加速分子动力学（temperature-accelerated molecular dynamics, TAMD）和扩展系统自适应偏置力（extended-system adaptive biasing force, eABF）两种增强采样方法计算了肽-蛋白解离的自由能曲线，并据此估算平衡解离常数（K_d）。
体外验证方面，研究使用小鼠脑内皮细胞系bEnd.3构建二维Transwell血脑屏障模型，通过跨内皮电阻（transendothelial electrical resistance, TEER）监测屏障完整性。同时，利用荧光素异硫氰酸酯标记的右旋糖酐（FITC-dextran，分子量分别为4 kDa、40 kDa和70 kDa）评估旁细胞通透性变化。肽与mCLDN5的结合亲和力通过微量热泳动（microscale thermophoresis, MST）技术测定，使用转染了Turbo GFP标记的mCLDN5的人胚肾293T细胞裂解液作为蛋白来源。此外，研究还通过免疫印迹、免疫荧光共聚焦显微镜和表面生物素化实验，分析了紧密连接蛋白（CLDN5、occludin、ZO-1）的表达水平和亚细胞定位变化。
主要实验结果
在计算溶解度和实验LC-MS验证中，f1-C5C2肽（序列ESVLALNAEVQAAR，对应小鼠CLDN5第68至81位残基，含S74N替换）和f3-cCPE-mut1肽被归类为可溶性，而f2-C5C2肽由于缺乏N端谷氨酸和丝氨酸残基而表现出明显的聚集倾向和低溶解度。在DMEM中，f1-C5C2的实测浓度约为目标浓度的60%（约15 μM），f3-cCPE-mut1达到目标浓度25 μM，而f2-C5C2仅约5 μM，被定义为不可溶。
标准MD模拟显示，mCLDN5与f1-C5C2的复合物在200纳秒内保持结合状态，肽段向ECL1结构域移动并形成多个持续存在的氢键，涉及mCLDN5的S69、V70、L71和V154残基。相反，mCLDN5与f3-cCPE-mut1的复合物在模拟过程中迅速解离，肽扩散进入溶剂。TAMD自由能计算进一步表明，f1-C5C2在蛋白-肽质心距离约10.3 Å处存在约−6 kcal/mol的自由能最小值，估算K_d约为57.9 μM；而f3-cCPE-mut1的自由能曲线呈排斥性特征，无稳定结合态。MST实验结果与计算预测高度一致，测得f1-C5C2的K_d约为68.3 μM，而f3-cCPE-mut1和对照样品均未显示可测量的结合亲和力。
功能实验中，25 μM的f1-C5C2连续孵育bEnd.3细胞单层导致了显著的TEER下降，在8小时时降低约40%，并维持较长时间。平行的右旋糖酐转运实验显示，f1-C5C2可显著促进FD4（4 kDa）从顶端侧向基底侧的转运，起始于8小时；FD40（40 kDa）的转运增强从24小时开始显著；而FD70（70 kDa）的转运未见明显变化。这一尺寸选择性特征表明f1-C5C2诱导的旁细胞通道开放是有限度的，对于避免大分子或病原体的非选择性进入具有潜在安全意义。f3-cCPE-mut1在所有功能测试中均未引起TEER或右旋糖酐转运的显著变化，与对照无异。
机制研究方面，免疫印迹分析显示，25 μM f1-C5C2处理24小时后，bEnd.3细胞中CLDN5、occludin和ZO-1的总蛋白水平均显著下调，而肌动蛋白表达未变。共聚焦免疫荧光定量分析表明，f1-C5C2处理后6至8小时，CLDN5的细胞质/细胞膜荧光比值显著升高，提示CLDN5从紧密连接复合体向胞内发生内化。表面生物素化实验进一步证实，处理24小时后膜表面CLDN5比例下降，胞质内CLDN5比例相应上升，而胞质标志物GAPDH和膜标志物Na+/K+-ATPase 1未发生改变。在多细胞模型中（周细胞与bEnd.3共培养），f1-C5C2同样引起TEER降低，但效应较轻，可能与屏障更加致密有关。
在可逆性实验中，研究发现若仅进行8小时的脉冲式孵育（pulse incubation），在撤除f1-C5C2后，TEER值在48小时内完全恢复至对照水平。此时紧密连接蛋白的总表达量在连续孵育和脉冲孵育组中均已恢复，但连续孵育组的CLDN5仍呈现明显的胞质内化，而脉冲组则恢复了正常的膜定位。
研究结论与意义
本研究成功设计并鉴定了一个14个氨基酸的短肽f1-C5C2，该肽来源于CLDN5的ECL1结构域，能特异性结合CLDN5并瞬时增强血脑屏障的旁细胞通透性。其作用机制至少部分涉及促进CLDN5从紧密连接复合体的内化，进而削弱紧密连接屏障功能。重要的是，短时脉冲式暴露可在48小时内实现屏障完整性的完全恢复，表明其具有可逆性调控的潜力。
该研究的科学价值在于建立了一套整合结构建模、全原子MD模拟、增强采样自由能计算和多种体外实验验证的高效筛选平台，成功将肽段长度压缩至20个氨基酸以内，解决了此前CLDN5调节肽因链长而面临的溶解度和临床转化难题。其应用价值在于为脑部疾病治疗提供了潜在的药物递送增强策略，尤其在葡萄糖转运体1缺乏综合征等需要改善脑内物质供应的遗传性疾病中具有转化前景。
研究亮点
本研究的突出亮点包括：1）从CLDN5自身胞外环序列中鉴定出短肽f1-C5C2，通过计算与实验相结合证明了其对CLDN5的微摩尔级亲和力；2）利用TAMD和eABF两种独立的增强采样方法获得一致的结合自由能，并与MST实验值高度吻合；3）在体外血脑屏障模型中展示了尺寸选择性、瞬时性和可逆性的旁细胞通透性增强；4）揭示了肽诱导紧密连接蛋白内化的作用机制，为后续优化和转化研究奠定了坚实基础。