一项关于可见光控制细胞内超分子肽纳米结构组装的研究报告
作者：Yong Ren、Zhixuan Zhou、Iain Harley、Özlem Aydin、Leon Driehaus-Ortiz、Anke Kaltbeitzel、Jiaqi Xing、Konrad Maxeiner、Ingo Lieberwirth、Katharina Landfester、David Y. W. Ng 及 Tanja Weil
主要机构：马克斯·普朗克聚合物研究所（Max Planck Institute for Polymer Research）等
发表期刊：Nature Synthesis
发表时间：2025年6月（第4卷第673–683页），2025年3月12日在线发表

一、研究背景与目的
分子自组装（molecular self-assembly）在细胞生命中扮演着不可或缺的角色，但合成超分子系统在活细胞环境中的复杂动态变化，使短暂存在的层级组装物种与其生物学功能之间的构效关系难以建立。传统上，许多参数如温度、寿命、单体和中间体的局部浓度以及成核阈值，都会影响自组装路径和后续纳米结构的生长。细胞内不同微环境还会进一步导致动力学驱动的亚稳态结构形成，增加聚集体的异质性。
研究者指出，实现构效关系的关键突破，在于一方面通过合成化学在离散时间点精确控制超分子事件，另一方面能够在天然细胞内实时可视化这些过程。现有光遗传学技术（optogenetic techniques）利用光操控蛋白质聚集、神经元功能和基因表达等，启发了研究者构建一个合成类似体系，即通过光化学来控制活细胞中的超分子化学与结构形成。基于可光裂解保护基团（photocleavable protecting groups, PPGs）的策略，特别是具有波长可调和光解速率可调的多功能香豆素衍生物（coumarin derivatives），为这一目标的实现提供了可能。
在此背景下，该研究旨在开发一种可见光响应性前组装肽序列，使其能够在活细胞内发生可见光诱导的分子和超分子转化，形成纳米纤维（nanofibres），并利用荧光寿命成像技术实时追踪组装动态，最终将组装过程与细胞毒性相关联。

二、研究流程与实验方法
研究首先设计和合成了两种光笼化的前组装肽（photocaged pro-assembling peptides）——前体1和前体2。这两种前体包含四个关键功能模块：自组装肽序列Fmoc-ISV、作为荧光寿命成像报告基团的IR780近红外荧光团、可被505 nm可见光裂解的红移香豆素光笼（red-shifted coumarin photocage）以及由五个精氨酸残基构成的细胞穿膜肽（cell-penetrating peptide, Arg5）。穿膜肽的极性既能阻止前体预先组装，又能促进细胞摄取。前体1与前体2以9:1的摩尔比使用，因为前体2的光解产物2a不能单独自组装成纳米纤维，必须与1a发生共组装（co-assembly）。合成路线综合了固相肽合成（solid-phase peptide synthesis, SPPS）和溶液相方法，关键的光笼-肽偶联通过铜催化的叠氮-炔环加成反应实现，随后通过95%三氟乙酸脱保护得到目标产物，并通过液相色谱-质谱联用（LC-MS）和基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI-MS）进行表征。
在体外光解动力学研究中，前体1在20 mM NH4HCO3缓冲液（pH 7.4）中，于505 nm、9.2 mW cm⁻²的光照下发生酯键水解，生成自组装肽1a和释放的光笼-Arg5片段3。LC-MS动力学分析显示，照射20分钟转化率可达98%，30分钟实现完全转化。光解过程伴随紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱的特征性变化，同时动态光散射（DLS）分析和时间依赖性透射电子显微镜（TEM）以及冷冻高分辨TEM证实了纳米纤维的逐步形成：照射5分钟时仅出现少量纤维片段，15分钟时纤维数量显著增加，30分钟时形成致密的纳米纤维网络。时间依赖性圆二色光谱（CD）在203 nm处出现不断增强的信号，表明β-折叠（β-sheet）有序二级结构的形成。
研究者利用Phasor-荧光寿命成像显微镜（Phasor-FLIM）对A549人肺腺癌细胞内组装过程进行实时追踪。细胞首先与25 μM的前体1+2（9:1比例）共孵育4小时以实现峰值摄取，随后洗涤去除胞外多余前体，再用505 nm光照射不同时间（5、10、15、30、40分钟）。通过时间相关单光子计数方法获取荧光寿命数据，并转化为Phasor图上的坐标点。Phasor分析能够区分自由单体（荧光寿命τf = 1.20 ns）、寡聚体中间体（τf = 0.75 ns）和成熟组装体（τf = 0.17 ns）三种主要物种。此外，研究者还运用关联光-电镜成像（correlative light-electron microscopy, CLEM）在照射15分钟后的细胞质和内涵体样囊泡结构中直接观察到纳米纤维的存在。
在机制解析方面，研究者设计了“照射-暗孵育”时间分辨实验，探索光解阶段与超分子组装阶段之间的动力学关系。细胞经4小时摄取后，分别照射5、10、15、30分钟，再在黑暗中孵育1–4小时，随后进行Phasor分析和细胞活力测定（CellTiter-Glo发光法），以揭示单体生成速率与消耗速率对组装进程和后续生物效应的影响。同时设置了一系列对照实验，排除505 nm光源本身的光毒性、IR780染料的光毒性以及光解副产物3的细胞毒性。

三、主要结果
实验结果表明，该光笼化前组装肽系统成功实现了在活细胞内由可见光精确触发和控制超分子组装。Phasor-FLIM时间进程分析显示，未光照时前体保持单体状态（τf = 1.20 ns）。照射5分钟后，仍以单体为主，但已出现τf > 0.75 ns的寡聚体物种；照射10分钟时出现τf = 0.17 ns的成熟纤维光子群，同时细胞形态开始发生改变。随着照射延长至15分钟，单体进一步消耗，寡聚体和组装体比例增加；30分钟时胞内前体基本转化完毕，大部分光子移动至τf = 0.17 ns区域；40分钟时实现完全转化。若将光强调至50%（4.6 mW cm⁻²），则需要30分钟才开始组装，40分钟才完全消耗单体，证明该体系可通过光照强度和时间灵活调控胞内组装动力学。CLEM分析在照射15分钟后的细胞中直接观察到纳米纤维，分布在胞质和内涵体等区室中，与Arg5介导的内吞途径相符。
在时间分辨暗孵育实验中，研究者揭示了光解产生单体的速率与组装消耗单体速率之间的博弈。照射5分钟后即使暗孵育4小时，光子群仍保持在1.20 ns > τf > 0.75 ns区间，表明单体浓度虽已超越临界聚集浓度（critical aggregation concentration, CAC），从而实现成核，但尚未达到能推动链增长传播的临界浓度，因此组装停滞在成核与寡聚体阶段。照射10分钟后，1小时暗孵育使成核增强，4小时后绝大多数单体被消耗，说明此时单体生成量已超过组装的消耗速率，光照虽停止，过量单体仍能继续驱动组装进程。照射15分钟后，4小时暗孵育使光子群进一步迁移至0.75 ns > τf > 0.17 ns范围，寡聚体向更大组装体传播的数量显著多于10分钟组。照射30分钟后，暗孵育2小时导致组装体显著增多，3小时实现寡聚体和剩余单体向组装体的完全转变。
与组装动力学高度关联的细胞活力分析表明，照射5分钟后的任何时间点均未观察到毒性；照射10分钟后，第1小时毒性不显，但从第2小时至第4小时细胞活力下降约50%；照射15分钟组在2小时内使细胞活力降至约10%；照射30分钟组立即表现出明显毒性（活力约37%），4小时后降至5%以下。综合Phasor分析与活力数据可知，组装早期的寡聚体形成并不诱导线粒体毒性，但随着寡聚体累积和进一步传播为更大的组装体，便出现显著的细胞毒性效应，且组装体数量越多，毒性越强。对照实验确认光源、IR780染料单体及光解副产物3均对A549细胞无显著损伤，毒性仅来源于光照诱导形成的纳米结构。

四、结论与价值
该研究成功开发了一种可见光调控的细胞内超分子自组装平台，将香豆素光笼、自组装肽序列、近红外荧光报告基团和穿膜肽有机整合，实现了在时间和空间上对活细胞中纳米纤维形成的精准操控与实时成像。通过综合运用Phasor-FLIM、CLEM、CD、DLS和TEM等手段，研究者不仅实时分辨了单体、寡聚体和成熟组装体等不同组装状态，还首次揭示了光解生成单体的速率与其组装消耗速率之间的动态平衡对超分子聚合传播的决定性影响。当单体生成速率超过消耗速率时，即便关闭光源，过量的活性单体仍会持续驱动组装完成，导致延迟但更彻底的细胞毒性。这一发现为理解合成超分子系统在复杂胞内环境中的构效关系提供了全新视角。
就科学价值而言，这项工作将超分子化学与细胞生物学深度交叉，展示了利用外源非入侵性刺激（可见光）在活细胞内精确控制自组装过程的可行性，为构筑人工纳米结构、合成细胞器或功能区室等前沿领域奠定了方法学基础。在应用价值层面，该平台提供的对组装状态和动力学的精细控制能力，有望在超分子药物发现、细胞内精准诊疗以及相关生物医学研究中得到应用，例如通过调节光照参数选择性地在病变细胞中触发毒性组装体，实现靶向治疗。此外，Phasor-FLIM分析技术在本研究中展示出在细胞内实时、原位分辨多种组装物种的强大功能，为其他动态超分子体系的活细胞研究提供了可借鉴的成像范式。

五、研究亮点
这项研究的亮点主要体现在以下几个方面。一是设计了一种全新的多功能光笼化前组装肽，集自组装能力、光控释放、荧光报告和细胞穿膜功能于一身，并通过共组装策略解决了单序列无法自组装的问题。二是实现了在活细胞内由可见光完全控制超分子组装进程，突破了传统内源性刺激响应系统无法实现时间离散控制的局限。三是开发并应用了Phasor-FLIM与CLEM联合成像策略，首次将胞内超分子组装过程中的离散中间态与最终纳米纤维形态直接联系，为构效关系解析提供了关键证据。四是揭示了“光照停止后过度生成单体仍能延续组装并加剧毒性”这一动力学规律，即当光解生成活性单体的速率超过其组装消耗速率时，剩余单体和未消耗寡聚体会在暗环境中继续推进组装完成。这一发现纠正了对光触发组装系统“即关即停”的简单假设，强调了对超分子阶段动力学进行管理的重要性。该研究在分子设计、成像策略和机制解析三方面均实现了显著创新，为人工超分子系统在活体内的操控与应用开辟了新途径。