本研究由天津中医药大学的Lu Yu、Shu Liu、Xu Wang（共同第一作者）以及通讯作者Nan Li、Chunquan Yu和Lin Li领导的团队完成。论文发表于*Journal of Ethnopharmacology*第360卷（2026年），题为“Tongmai Yangxin Pill mitigates myocardial ischemia/reperfusion injury by improving mitochondrial function and mitophagy: a potential role of estrogen receptor alpha and PTEN-induced putative kinase 1/Parkin pathway”（通脉养心丸通过改善线粒体功能和线粒体自噬减轻心肌缺血/再灌注损伤：雌激素受体α与PINK1/Parkin通路的潜在作用）。

一、 研究背景与研究目的

心肌缺血/再灌注损伤（myocardial ischemia/reperfusion injury, MI/RI）是急性心肌梗死治疗中常见的并发症，约50%的最终梗死面积可归因于此，而临床上仍缺乏有效的治疗手段。线粒体功能障碍是MI/RI的核心病理环节，其引发的线粒体自噬（mitophagy）过度激活，会导致心肌细胞能量供应衰竭和细胞死亡。研究表明，PTEN诱导激酶1（PINK1）和Parkin蛋白在MI/RI中均上调，调控此通路可能是治疗MI/RI的关键策略。中药复方通脉养心丸（Tongmai Yangxin Pill, TMYX）源自《伤寒论》炙甘草汤，是国家药品监督管理局批准用于治疗心脑血管疾病的上市药物，但其作用机制尚未完全阐明。基于前期研究发现TMYX可通过雌激素受体α（estrogen receptor α, ERα）调节线粒体融合-分裂动力学，本研究旨在探究TMYX是否通过激活ERα，调控PINK1/Parkin信号通路，从而改善线粒体自噬缺陷，以发挥对MI/RI的心肌保护作用。

二、 研究工作流程

本研究采用“体内-体外-生物信息学”整合策略，分为三个主要阶段逐步深入。

• 第一阶段：TMYX对MI/RI大鼠心脏保护作用的药效学评估。

  1. 模型建立与给药：研究使用雄性Sprague-Dawley大鼠，通过结扎左冠状动脉前降支30分钟后再灌注2小时，建立MI/RI模型。将射血分数（ejection fraction, EF）低于50%的造模成功大鼠随机分为模型组（MI/RI）、TMYX低、中、高剂量组（1.0, 2.0, 4.0 g/kg/d）和阳性药雷洛昔芬（Raloxifene）组。假手术组（Sham）仅穿线不结扎。各组提前连续灌胃给药7天。
  2. 检测指标：术后，通过超声心动图评估心功能，H&E和Masson染色评估心肌组织病理学改变与纤维化程度，TTC/伊文思蓝染色测定心肌梗死面积，并检测血清中氧化应激标志物超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）和丙二醛（malondialdehyde, MDA）的水平。

• 第二阶段：TMYX药效物质基础及潜在作用机制预测。

  1. 药物成分分析与鉴定：利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱（UPLC-Q-TOF-MS/MS）技术，对TMYX丸剂的化学成分及其在大鼠血浆和心脏组织中的移行成分进行全面鉴定。
  2. 网络药理学与生物信息学分析：将鉴定出的148个主要化合物结构通过PharmMapper服务器预测其作用靶点。同时，从Gene Expression Omnibus (GEO)数据库获取MI/RI相关的mRNA微阵列数据集（GSE61592, GSE108940）进行差异表达基因（differential expression gene, DEG）分析，并采用加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis, WGCNA）筛选与MI/RI表型最显著相关的核心基因模块。通过构建“药物靶点-疾病靶点-核心模块基因”的交集网络，进行蛋白质-蛋白质相互作用（protein–protein interaction, PPI）分析和GO/KEGG富集分析，预测TMYX治疗MI/RI的核心靶点和通路。
  3. 机制预测与初步验证：采用双荧光素酶报告基因实验验证TMYX对ERα转录活性的影响。并选取TMYX中用于标准化的5个含量丰富、色谱特性稳定的核心化合物（甘草酸、甘草次酸、甘草苷、甘草素、异甘草素），与预测的关键蛋白PINK1和Parkin进行分子对接，评估其结合能力。

• 第三阶段：关键作用机制的体内外实验验证。

  1. 线粒体功能评估：在MI/RI大鼠模型中，检测心肌组织的ATP含量和线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential, Δψm），以及线粒体生物合成相关基因（Tfam, *Nrf1*）的mRNA表达和线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）拷贝数，以评估TMYX对线粒体生物合成和能量代谢的影响。
  2. 细胞水平靶点验证：建立H9c2大鼠心肌细胞的缺氧/复氧（hypoxia/reoxygenation, H/R）模型以在体外模拟MI/RI。使用小干扰RNA（siRNA）技术在H9c2细胞中特异性沉默ERα的表达。在ERα沉默背景下，给予TMYX处理，通过RT-qPCR和Western blot检测线粒体自噬通路关键基因（Pink1, Parkin, Beclin1, *p62*）的mRNA和蛋白表达水平，并结合线粒体生物合成指标，以确定ERα是否为TMYX调控线粒体自噬的必经途径。

三、 主要研究结果

本研究的药效学评估首次证实，TMYX能够剂量依赖性地改善MI/RI大鼠的心功能，具体表现为显著降低左室舒张末期内径（left ventricular end-diastolic diameter, LVIDd）、左室收缩末期内径（left ventricular end-systolic diameter, LVIDs）和左室质量（left ventricular mass, LV mass），并提高EF和左室短轴缩短率（fractional shortening, FS）。组织学分析显示，TMYX显著减轻了心肌坏死、中性粒细胞浸润以及心肌间质和血管周围的纤维化。此外，TMYX处理组大鼠的心肌梗死面积显著减小，并表现出明显的抗氧化应激活性，即提高SOD水平、降低MDA水平。

在机制预测阶段，UPLC-Q-TOF-MS/MS分析共鉴定出148个TMYX化学成分，涵盖黄酮、萜类、酚酸、生物碱等。经过数据库挖掘、WGCNA和PPI网络拓扑分析，鉴定出15个TMYX治疗MI/RI的核心靶点。功能富集分析将ERα（由*Esr1*基因编码）推至调控网络的核心，并揭示其与线粒体自噬和雌激素信号通路显著相关。双荧光素酶报告基因实验证实，TMYX能呈剂量依赖性地激活ERα的转录活性，显示了其类雌激素样作用。分子对接结果也表明，甘草酸等5种核心成分与PINK1和Parkin蛋白均有很强的结合亲和力。这些数据共同指向一个假设：TMYX可能通过其雌激素样成分激活ERα，进而调控PINK1/Parkin介导的线粒体自噬。

针对上述假设的验证实验得出了关键结果。在体内，TMYX显著恢复了MI/RI大鼠心脏的ATP合成水平和Δψm，并上调了*Tfam*和*Nrf1*的mRNA表达，增加了mtDNA拷贝数，表明其促进了线粒体生物合成和能量代谢的恢复。在体外，H/R损伤导致H9c2细胞中Pink1, Parkin, Beclin1, *p62*的mRNA和蛋白水平异常高表达，而TMYX处理能显著逆转这一趋势，表明其可抑制MI/RI状态下过度激活的线粒体自噬。最为关键的是，当使用siRNA沉默ERα后，TMYX对上述所有指标的改善作用均被显著削弱或抵消，包括线粒体生物合成标志物的上调和对PINK1/Parkin通路过度激活的抑制作用。这直接证明了ERα是TMYX发挥其线粒体保护和线粒体自噬调控作用的一个不可或缺的上游关键分子。

四、 研究结论与价值

本研究首次阐明，通脉养心丸（TMYX）通过其活性成分激活ERα，进而调节下游的PINK1/Parkin信号通路，纠正了MI/RI过程中线粒体自噬的失衡状态，从而维持线粒体稳态，最终发挥心脏保护作用。该研究不仅在科学上将传统中药TMYX的作用机制从宏观的“线粒体保护”推进到具体的“ERα-PINK1/Parkin-线粒体自噬”这一明确分子通路，为中药复方的作用机制研究提供了新范式；在应用价值上，也为TMYX的临床应用提供了坚实的现代药理学证据，并确立了其作为开发靶向线粒体自噬的心脏保护疗法的潜力候选药物。此外，研究证实植物雌激素可通过靶向ERα调控线粒体质量控制系统，为探索更安全的激素替代疗法提供了新思路。

五、 研究亮点

本研究的亮点主要体现在以下三个方面： * 方法整合创新：将UPLC-Q-TOF-MS/MS的成分分析，从传统网络药理学，推进到整合WGCNA和GEO真实世界疾病转录组数据，进行精确靶点预测，再通过基因沉默进行因果验证，构建了“药物成分-体内移行成分-生物信息预测-靶点功能验证”的完整证据链，显著提高了机制研究的生物相关性和可靠性。 * 机制发现深化：揭示了TMYX心肌保护作用的新机制，即通过ERα激活，并行地促进线粒体生物合成和抑制PINK1/Parkin介导的过度线粒体自噬，从“开源”和“节流”两方面协同修复受损的线粒体稳态，而非单一途径。 * 研究结论转化潜力：研究直接将一个已上市的中成药与前沿的线粒体自噬调控靶点联系起来，为TMYX的精准临床应用和二次开发指明了方向。同时，研究中使用的ERα阳性药雷洛昔芬作为对照，凸显了TMYX类雌激素样效应的独特价值。