基于逆折叠模型整合结构与进化约束的蛋白质进化方法研究

作者及机构
本研究由Hongyuan Fei、Yunjia Li、Yijing Liu、Jingjing Wei、Aojie Chen和Caixia Gao共同完成，主要来自中国科学院遗传与发育生物学研究所基因组编辑中心（New Cornerstone Science Laboratory, Center for Genome Editing）和中国科学院大学（University of Chinese Academy of Sciences）。研究成果于2025年8月21日发表在Cell期刊（卷188，页1–19），标题为《Advancing Protein Evolution with Inverse Folding Models Integrating Structural and Evolutionary Constraints》。

学术背景
蛋白质工程通过定向进化或理性设计改造蛋白质序列，以优化其功能，但传统方法存在成功率低、成本高、依赖专家经验等问题。近年来，基于深度学习的蛋白质设计方法（如ESM-IF1、ProteinMPNN）通过逆折叠（inverse folding）模型从结构预测序列，但这类模型在复杂蛋白质（如基因组编辑工具）中的应用仍受限。本研究提出AICE（AI-informed Constraints for protein Engineering）框架，通过整合结构柔性区域筛选和进化耦合（evolutionary coupling, EC）分析，实现高效的高适应性（high-fitness, HF）突变设计，并应用于碱基编辑器的开发。

研究流程

1. AICE单突变设计（AICE Single）

   • 数据基础：使用31个大规模深度突变扫描（deep mutational scanning, DMS）数据集，涵盖27个蛋白质家族（如Cas9、p53、SARS-CoV-2 Spike蛋白）。
     
   • 方法：
     
     • 通过逆折叠模型（ESM-IF1、ProteinMPNN、LigandMPNN）生成与目标蛋白质骨架兼容的序列。
       
     • 计算突变出现频率（appearance rate），筛选高频突变，并引入结构约束：将突变分为柔性区（flexible regions）和非柔性区，发现柔性区突变更易提升适应性（p < 0.0001）。
       
     • 定义筛选阈值（β = 0.8为全局阈值，γ = 0.5为柔性区阈值），显著提高HF突变预测准确率（35% vs. 随机设计的5%）。
       
   • 验证：在Cas9和抗体CR6261中，AICE预测的突变（如Cas12的N199K、SARS-CoV-2 Spike的Q414A）与实验数据一致。
     

2. AICE组合突变设计（AICE Multi）

   • 原理：基于进化耦合（EC）和连锁不平衡（linkage disequilibrium, LD）分析，预测协同突变。
     
   • 实验验证：
     
     • 在抗体CR9114中，AICE Multi预测的多突变组合与实验测定的解离常数（Kd）显著相关（Spearman相关系数0.32–0.64）。
       
     • 在组蛋白HIS3和荧光蛋白ppluGFP2中，AICE Multi设计的组合突变（如5突变组合SC16）活性提升54%，且负 epistasis效应更低。
       

3. 碱基编辑器优化

   • 单链DNA腺嘌呤脱氨酶（TADA8E）：通过AICE Single设计122个突变，其中13个提升编辑效率（如E1M效率提升70%），并开发出编辑窗口更窄的enABE8e（4 bp窗口）。
     
   • 单链DNA胞嘧啶脱氨酶（SDD6）：AICE Multi设计的SC9（F124K/K130T）在HEK293T细胞中编辑效率提升1.7倍，且脱靶率降低30%。
     
   • 双链DNA脱氨酶（DDD1）：针对线粒体编辑环境优化的enDDD1（V61L/T110I）活性提升14.3倍，优于传统定向进化获得的DDDA11。
     

主要结果
1. 结构约束提升预测准确性：柔性区突变占HF突变的65%，且AICE Single的预测准确率比全局筛选高18%。
2. 进化耦合减少负 epistasis：AICE Multi设计的组合突变中，80%避免功能冲突，而基于BLOSUM62矩阵的突变仅44%有效。
3. 应用成果：
- enABE8e编辑窗口缩小至4 bp，效率与ABE9相当；
- enSDD6-CBE的保真度提高1.3倍；
- enDDD1-DDCBE线粒体编辑效率提升14.3倍。

结论与意义
1. 科学价值：AICE首次将逆折叠模型的序列生成能力与结构-进化约束结合，为蛋白质工程提供了通用、低成本的解决方案。
2. 应用价值：开发的碱基编辑器在精准医学和农业中潜力显著，如亨廷顿病（HTT基因编辑）和线粒体遗传病矫正。
3. 方法论创新：AICE无需任务特异性模型训练，仅需1.15 CPU小时即可完成复杂蛋白质（如SpCas9）的突变设计。

研究亮点
1. 结构导向的柔性区筛选：揭示柔性区突变对功能优化的关键作用。
2. 进化耦合驱动的组合设计：通过EC/LD分析克服多突变协同难题。
3. 跨领域应用：成功优化8类蛋白质（从数十到数千氨基酸），包括核酸酶、逆转录酶和核定位序列（NLS）。

局限性：依赖结构预测精度，且对罕见突变覆盖不足。未来可通过整合分子动力学或实验数据进一步优化。

其他价值
- 开源资源：代码和数据已公开于GitHub（https://github.com/scorpiolea/aice）。
- 专利布局：已基于成果提交专利申请。