标题：靶向脂筏关联蛋白Stomatin改善骨质疏松症的机制与治疗潜力研究
本研究于2025年5月9日在《自然通讯》(Nature Communications)杂志上正式发表，论文标题为《靶向脂筏关联蛋白Stomatin以改善临床前模型中的骨质疏松症》。该研究由以下团队合作完成：通讯作者为苏州大学附属第一医院骨科耿德春教授、海军军医大学长征医院周琦教授、海安市人民医院骨科吕淑军教授，以及苏州大学附属第一医院骨科杨惠林教授。第一作者包括苏州大学附属第一医院骨科陶华强博士、海安市人民医院骨科陈凯博士和苏州大学附属第一医院/常熟市第一人民医院骨科王秋飞博士等。研究机构涵盖了苏州大学附属第一医院、海安市人民医院、常熟市第一人民医院以及海军军医大学长征医院。
本项研究的学术领域聚焦于骨骼代谢生理学与疾病机制，具体涉及骨质疏松症的病理生理学、破骨细胞分化调控以及细胞膜微结构域（脂筏）的信号转导功能。骨质疏松症是一种以骨吸收与骨形成失衡为特征的全身性骨病，随着全球人口老龄化，其患病率日益攀升，导致脆性骨折风险显著增加，给公共卫生系统带来沉重负担。尽管现有疗法如RANKL单克隆抗体能抑制破骨细胞活性，但长期使用存在副作用风险，因此寻找新的治疗靶点至关重要。细胞膜上的脂筏作为富含胆固醇和鞘脂的纳米级有序结构域，在细胞信号转导中扮演关键角色。其中，SPFH蛋白家族是脂筏的重要组成部分，但除Flotillin外，其他成员如Stomatin在骨骼生理调控中的具体作用和机制尚不明确。因此，本研究旨在探究Stomatin在骨质疏松症发生发展中的作用，揭示其调控破骨细胞分化的分子机制，并评估靶向干预Stomatin作为骨质疏松症治疗新策略的潜力。
研究的详细工作流程严谨而系统，可分为多个相互关联的步骤：
首先，研究团队通过生物信息学分析和临床样本验证，确定了Stomatin在骨质疏松症中的表达模式。他们分析了GEO数据库中骨质疏松症患者的单细胞测序数据，发现Stomatin在患者骨髓间充质干细胞、中性粒细胞和巨噬细胞中高表达。随后，收集了骨质疏松症患者和非骨质疏松症患者的股骨颈组织样本进行免疫荧光染色，证实了在骨质疏松症患者的骨髓间充质干细胞和巨噬细胞中，Stomatin蛋白水平显著升高。在动物模型层面，通过对卵巢切除诱导的骨质疏松小鼠模型进行检测，也发现其骨组织中Stomatin表达上调，这与人类样本的发现一致。这些初步发现将Stomatin的表达与骨丢失过程联系起来。
其次，为了探究Stomatin在体内的功能，研究团队构建了系统性Stomatin基因敲除小鼠。通过CRISPR/Cas9技术成功获得了Stomatin敲除小鼠，并通过基因型鉴定和蛋白印迹验证了敲除效率。对12周龄野生型和敲除小鼠的股骨远端进行Micro-CT扫描分析，结果显示Stomatin敲除小鼠的骨矿物质密度、骨体积、骨小梁数量和厚度均显著增加，而骨小梁间距减小，表明系统性敲除Stomatin能提高小鼠的骨量。组织形态学分析进一步发现，虽然Stomatin敲除小鼠的成骨细胞活性和矿化面积有所下降，但其破骨细胞的形成和骨吸收功能受到更为显著的抑制。通过体外实验，从Stomatin敲除小鼠骨髓中提取的原代细胞，在RANKL和M-CSF诱导下向破骨细胞分化的能力以及骨吸收功能均明显减弱。这一系列体内外实验表明，Stomatin缺失导致的骨量增加，主要归因于其对破骨细胞活性的更强抑制效应。
第三，为了更精确地解析Stomatin在破骨细胞谱系中的作用，并排除全身性敲除可能带来的其他系统影响，研究团队构建了破骨细胞谱系特异性Stomatin敲除小鼠。他们将Stomatin-floxed小鼠与Ctsk-Cre小鼠杂交，获得了在Ctsk阳性破骨细胞中特异性缺失Stomatin的小鼠。结果显示，与对照小鼠相比，特异性敲除小鼠在生理状态下骨量增加，骨小梁面积更大，破骨细胞数量减少。更重要的是，在对这些小鼠进行卵巢切除手术后，其骨丢失的速度显著减缓，破骨细胞活化同样受到抑制。这直接证明了Stomatin在破骨细胞中发挥促进骨吸收的关键作用。
第四，研究深入探索了Stomatin调控破骨细胞活化的分子机制。体外实验方面，从野生型和Stomatin敲除小鼠中分离骨髓来源巨噬细胞，诱导其向破骨细胞分化。通过小干扰RNA敲低和过表达质粒过载Stomatin，证实Stomatin能直接促进破骨细胞标志物的表达、多核细胞形成和骨吸收陷窝的形成。为了揭示其下游信号通路，研究人员对野生型和敲除小鼠的骨髓巨噬细胞进行了全转录组RNA测序。测序和生物信息学分析显示，Stomatin敲除导致破骨细胞分化相关基因下调，而多种抗氧化基因如SOD1、SOD2、NQO1、HMOX1的表达上调。基因集富集分析也提示差异基因在氧化应激反应通路中富集。后续实验通过流式细胞术、MitoSOX染色和JC-1染色等证实，Stomatin的过表达会显著增加细胞内和线粒体内的活性氧水平，提高ATP产量，并导致线粒体膜电位升高和线粒体嵴模糊；而抑制Stomatin则产生相反效果。使用ROS抑制剂N-乙酰半胱氨酸能逆转Stomatin过表达引起的破骨细胞过度活化。这些结果将Stomatin的功能与细胞内氧化还原态联系起来。
第五，为了寻找Stomatin调控氧化应激的直接靶点，研究人员采用了免疫共沉淀结合质谱分析技术。他们发现Stomatin与一种重要的抗氧化蛋白Peroxiredoxin 1相互作用。通过分子对接、点突变和Co-IP实验，确认了PRDX1蛋白链的Thr18残基与Stomatin蛋白的Asp140残基之间存在氢键结合。机制研究表明，Stomatin与PRDX1结合后，并非通过蛋白酶体途径，而是通过溶酶体途径（特别是巨自噬和分子伴侣介导的自噬）促进PRDX1的降解。这种降解导致细胞内抗氧化能力下降，ROS积累。功能挽救实验显示，在过表达Stomatin的同时过表达PRDX1，能有效抑制ROS的激增，并挽救由Stomatin过表达所促进的破骨细胞分化和骨吸收活性。这明确了PRDX1是Stomatin下游介导氧化应激和破骨细胞活化的关键效应分子。
第六，基于上述机制研究，团队开发了针对性的基因治疗策略以验证其治疗潜力。他们构建了靶向巨噬细胞特异性启动子F4/80的腺相关病毒，用于在体内特异性敲低巨噬细胞中的Stomatin表达。将这种AAV-shStomF4/80通过骨髓腔内注射给予卵巢切除小鼠。八周后评估发现，与仅接受手术或注射对照病毒的模型组小鼠相比，治疗组小鼠的骨量丢失得到显著缓解，骨小梁微结构改善，骨组织中的破骨细胞数量和血清骨吸收标志物CTX-1水平均明显下降。重要的是，病毒注射未对小鼠的肝脏、肾脏等主要脏器功能产生显著影响，显示了该靶向策略的安全性。此外，研究还初步探讨了Stomatin在骨髓脂肪细胞中的作用，发现其敲除同样能抑制脂肪细胞分化，并且使用靶向脂肪细胞特异性启动子Fabp4的AAV部分逆转了卵巢切除引起的骨丢失，提示Stomatin也可能通过调控骨髓脂肪细胞影响骨代谢。
研究的主要结论清晰而有力：脂筏关联蛋白Stomatin在骨质疏松症的病理进程中表达上调，是破骨细胞分化和骨吸收功能的正向调控因子。其作用机制在于与抗氧化蛋白PRDX1结合，并介导其通过溶酶体途径降解，从而削弱细胞的抗氧化防御能力，导致细胞内活性氧水平升高，进而激活破骨细胞生成信号通路。在动物模型中，无论是系统性还是破骨细胞特异性敲除Stomatin，都能有效缓解卵巢切除诱导的骨丢失。更重要的是，利用AAV载体靶向敲低巨噬细胞中的Stomatin表达，展现出良好的治疗效果和安全性。
本研究的科学价值与应用价值十分显著。在科学层面，首次系统阐明了Stomatin这一脂筏关键组分在骨骼代谢，特别是破骨细胞生物学中的核心作用，将细胞膜微结构域信号、氧化应激调控和骨吸收过程紧密联系起来，为理解骨质疏松症的分子机制提供了新的视角和理论依据。在应用层面，研究证实了Stomatin是一个极具潜力的骨质疏松症治疗新靶点。所开发的靶向巨噬细胞的基因治疗策略，为开发副作用更小、更具细胞特异性的抗骨吸收药物或生物制剂指明了新方向。初步在类风湿性关节炎小鼠模型中的探索也提示，靶向Stomatin可能对以破骨细胞过度活化为特征的其他骨骼疾病具有治疗价值。
本研究的亮点突出体现在以下几个方面：首先是研究策略的完整性，从临床现象（患者样本高表达）到动物模型验证（基因敲除鼠表型），再到深入的细胞分子机制解析（RNA-seq、IP-MS发现PRDX1互作及降解途径），最后回归到治疗探索（靶向AAV治疗），形成了闭环研究。其次是技术方法的先进性，综合运用了单细胞测序分析、CRISPR/Cas9基因编辑、条件性基因敲除、分子对接、活细胞成像、高分辨率Micro-CT以及靶向性AAV载体构建等多种前沿技术。第三是发现的新颖性，首次揭示了Stomatin通过调控PRDX1降解影响氧化应激，从而控制破骨细胞分化的全新机制。第四是转化意义的明确性，不仅揭示了新靶点，还通过巧妙的靶向载体设计，初步验证了其治疗可行性，为后续的药物研发奠定了坚实基础。
此外，研究还附带探索了Stomatin在骨髓脂肪细胞分化中的作用，这为进一步理解骨髓微环境中不同细胞类型间的交互对话及其在骨病中的作用开辟了新的探索路径，增加了研究的深度和广度。这项研究是一项从基础到转化、逻辑严密、证据扎实的优秀工作，为骨质疏松症的精准治疗带来了新的希望。