基于高分辨率碎裂质谱的系统性未知代谢物分类工具CANOPUS

作者及发表信息

本研究由德国耶拿大学（Friedrich-Schiller University）生物信息学主席Sebastian Böcker团队主导，联合美国加州大学圣地亚哥分校（University of California, San Diego）质谱创新中心、芬兰阿尔托大学（Aalto University）等9家机构共同完成，于2020年发表在*Nature Biotechnology*期刊（DOI: 10.1038/s41587-020-0740-8）。

研究背景

科学领域：该研究属于代谢组学（metabolomics）与计算质谱分析的交叉领域。

研究动机：
非靶向液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS）可检测生物样本中数千种小分子，但当前代谢物结构注释严重依赖已知数据库（如MassBank、GNPS），导致约90%的检测分子因缺乏参考数据而无法识别（”代谢暗物质”问题）。传统方法如分子网络（molecular networking）或数据库搜索（如CSI:FingerID）仅能覆盖有限结构类别，且无法处理无训练数据的化合物类别。

技术瓶颈：
1. 质谱库（spectral libraries）覆盖度低，主要包含商业化合物；
2. 结构数据库（structure databases）存在生物分子结构缺口；
3. 现有分类方法（如ClassyFire）需已知分子结构，无法直接应用于质谱数据。

研究目标：
开发名为CANOPUS（Class Assignment and Ontology Prediction Using Mass Spectrometry）的计算工具，实现两大突破：
- 直接从碎裂质谱（MS/MS）预测2,497种化合物类别（包括所有生物相关类别）
- 无需依赖MS/MS训练数据即可预测新类别

研究方法与流程

1. 算法架构设计

CANOPUS采用双层机器学习模型：
- 第一层：分子指纹预测
- 输入：高分辨率MS/MS谱图（质量精度<10 ppm）
- 方法：24,539个化合物的参考质谱训练支持向量机（SVM）电池，输出4,262维概率化分子指纹（molecular fingerprint）
- 创新点：采用结构不相交交叉验证（structure-disjoint cross-validation），确保评估时化合物结构完全未知

• 第二层：深度神经网络分类
  
  • 输入：SVM预测的分子指纹 + 分子式（由SIRIUS软件计算）
    
  • 训练数据：410万化合物结构（来自PubChem等数据库）及其ClassyFire类别
    
  • 网络结构：
    
  • 指纹层→3,000神经元全连接层（ReLU激活，50% Dropout）
    
  • 分子式层→16神经元全连接层
    
  • 联合层→3,000→8,000→2,497输出神经元（线性）
    
  • 关键创新：通过概率指纹模拟（probabilistic fingerprint simulation）解决训练与应用的数据分布差异
    

2. 评估方法

• 数据集：

  • 训练集：24,539个阳性离子模式MS/MS谱（NIST 2017、GNPS、MassBank）
    
  • 独立测试集：3,387个化合物（Agilent PCDL库）
    
  • 阴性离子模式：16,785个化合物
    

• 基线对比：
  与四种方法比较：

  1. 直接SVM预测（CSI kernel SVM）
     
  2. MetFrag KNN-5（结构数据库搜索）
     
  3. CSI:FingerID KNN-5
     
  4. 谱库KNN-5（余弦相似度）
     

• 评价指标：

  • 马修斯相关系数（MCC）
    
  • 精确度（precision）与召回率（recall）
    

3. 应用验证

选择三个生物学场景验证实用性：
1. 小鼠消化系统微生物定植效应：分析834个LC-MS/MS样本（4只无菌GF vs 4只SPF小鼠）
2. 大戟属植物（Euphorbia）化学多样性：43个物种的代谢组数据
3. 海洋天然产物发现：蓝细菌Rivularia sp.中新型环缩肽（cyclodepsipeptide）鉴定

主要研究结果

1. 算法性能

• 交叉验证：

  • 平均准确率99.7%
    
  • 2,³¹³⁄₂,497个类别预测准确率≥99%
    
  • 607个类别MCC≥0.8（如磷脂酰胆碱MCC=0.972）
    

• 独立测试：

  • 对416个”丰富类别”（≥20阳性样本）：平均MCC=0.744
    
  • 对2,081个”稀疏类别”：微平均MCC=0.603
    
  • 显著优于基线方法（如CSI:FingerID KNN-5 MCC=0.692）
    

• 无训练数据预测：

  • 移除491个黄酮苷（flavonoid glycosides）训练数据后，仍能以MCC=0.662预测该类别
    
  • 对比：直接SVM预测仅8%正确率
    

2. 生物学发现

小鼠微生物组：
- CANOPUS识别542个GF/SPF差异化合物（fold change>10）
- 胆汁酸（bile acids）：在结肠和粪便中SPF小鼠显著富集（p=6.58×10⁻¹⁵），印证了Quinn等（2020）的发现
- 葡萄糖醛酸衍生物（glucuronic acids）：在GF小鼠消化道累积，提示微生物参与糖苷脂代谢（如植物皂苷降解）

大戟属植物：
- 发现苯甲酸酯（benzoic acid esters）的亚属特异性分布：
- Esula亚属：462/745二萜被注释为苯甲酸酯
- 与传统研究相比，CANOPUS检测到更多化合物（Extended Data Fig. 6）
- 化学分类树（chemodendrogram）与基因组系统发育树高度一致（标准化四重距离=0.396）

天然产物发现：
- 鉴定新型环缩肽rivulariapeptolide 1155（C₅₉H₈₁N₉O₁₅）
- CANOPUS正确预测其类别为缩肽（depsipeptides）
- 质谱数据库搜索无匹配，CSI:FingerID前10候选均错误
- 通过NMR验证了CANOPUS预测的AHP（3-氨基-6-羟基-2-哌啶酮）结构

研究结论与价值

科学价值

1. 方法论突破：首次实现无需MS/MS训练数据的化合物分类，解决了代谢组学中”暗物质”注释难题
   
2. 技术整合：将深度神经网络与概率指纹预测结合，克服了传统方法对新类别化合物的识别局限
   
3. 生物学洞察：揭示了微生物-宿主互作中糖苷脂代谢的新机制，为大戟属植物次生代谢进化提供新证据
   

应用价值

• 开源工具：集成于SIRIUS 4.4软件（https://bio.informatik.uni-jena.de/software/sirius/）
  
• 多领域适用：
  
  • 天然产物发现（缩短结构鉴定周期）
    
  • 临床代谢组学（疾病标志物筛选）
    
  • 植物化学分类学（无需先验知识比较物种）
    

研究亮点

1. 全面性：覆盖ClassyFire中2,497个生物相关类别，远超现有工具
   
2. 鲁棒性：对无训练数据的类别仍保持高预测性能（如胆汁酸MCC=0.764）
   
3. 工作流整合：从特征检测到分类的全流程自动化，支持MZmine、OpenMS等平台数据输入
   
4. 跨学科影响：为化学生态学、微生物组研究、药物发现提供新分析范式
   

其他重要发现

• 分子网络注释优化：在344个分子子网络中，CANOPUS纠正了传统网络传播法（如MolNetEnhancer）的类别误判（图4a）
  
• 光呼吸代谢关联：大戟属植物的代谢组特征同时反映系统发育关系和CAM/C3光合途径适应