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本研究由Huihui Wang、Shaoping Kuang、Qiaolin Lang和Lei Wang共同完成，分别来自青岛科技大学环境与安全工程学院和青岛科技大学化学与分子工程学院。研究发表于2021年9月28日的《World Journal of Microbiology and Biotechnology》期刊上，论文标题为《Bacterial community structure of aged oil sludge contaminated soil revealed by Illumina high-throughput sequencing in East China》。
该研究的主要科学领域为环境微生物学，特别是针对石油污染土壤中的微生物群落结构及其在生物修复中的潜力。随着石油工业的快速发展，每年产生大量油泥（oily sludge），其不当处理会导致严重的环境污染，尤其是石油烃类（total petroleum hydrocarbons, TPHs）和重金属等有毒物质的积累。这些污染物不仅对人类健康构成威胁，还对生态系统造成长期压力。因此，研究石油污染土壤中的微生物群落结构及其功能，对于开发生物修复技术具有重要意义。
研究的背景知识包括：油泥中的石油烃类成分复杂，包括饱和烃、芳香烃、沥青质和树脂等，这些成分难以降解。此外，油泥中的重金属具有累积效应，进一步加剧了污染。传统的处理方法如焚烧、固化和氧化处理存在二次污染、成本高、效率低等问题，而生物修复技术则依赖于土著微生物的代谢潜力来降解污染物。因此，研究石油污染土壤中的微生物群落结构及其功能，对于开发高效、经济的生物修复技术至关重要。
本研究的目标是通过高通量测序技术（high-throughput sequencing）分析中国大庆油田（Daqing, DQ）和胜利油田（Shengli, SL）老化油泥（aged oil sludge, AOS）污染土壤中的细菌群落结构，揭示其多样性和组成，并探讨其在生物修复中的潜在应用。
研究分为以下几个主要步骤：
研究区域与样品采集
研究区域为中国的大庆油田和胜利油田。大庆油田位于黑龙江省，土壤类型主要为黑钙土和草甸土，具有较高的肥力；胜利油田位于山东省黄河三角洲，土壤盐分较高。研究团队在这两个油田采集了0-20厘米深度的土壤样品，样品经过干燥、混合后去除石块和植物残渣，随后进行理化性质分析和微生物基因组实验。
理化性质分析
对采集的土壤样品进行了pH、盐度、总有机碳（total organic carbon, TOC）、总石油烃（TPHs）、有效氮（available nitrogen, AN）和有效磷（available phosphorus, AP）等理化性质的测定。pH值使用pH计测量，盐度通过重量法测定，TOC采用Walkley-Black法测定，TPHs含量通过气相色谱法（gas chromatography, GC）分析。
基因组DNA提取与PCR扩增
使用E.Z.N.A.®土壤DNA提取试剂盒从0.5克土壤中提取基因组DNA。随后，使用通用引物515F和806R对细菌16S rRNA基因的V3-V4区域进行PCR扩增。扩增条件为：95°C预变性5分钟，随后进行27个循环（95°C 30秒，55°C 30秒，72°C 45秒），最后72°C延伸5分钟。
Illumina MiSeq测序
PCR扩增产物通过2%琼脂糖凝胶电泳分离，使用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒纯化，随后在Illumina MiSeq平台上进行双端测序（2×250 bp）。测序数据经过质量过滤后，使用UPARSE软件进行97%相似度的操作分类单元（operational taxonomic units, OTUs）聚类，并使用RDP分类器对16S rRNA基因序列进行系统发育分析。
数据分析
对测序数据进行了OTU聚类、物种丰度分析、多样性指数计算（如Shannon-Wiener指数、ACE指数和Chao1指数）以及主成分分析（principal component analysis, PCA）。通过Venn图比较了不同样品之间的OTU分布，并通过热图展示了主要菌属的相对丰度变化。
理化性质分析结果
大庆油田和胜利油田的土壤样品表现出不同的理化性质。大庆油田的TOC含量较高（12.53-28.35 g/kg），TPHs含量也显著高于胜利油田（21-2837 mg/kg）。胜利油田的土壤盐度较高（0.87-0.89%），而大庆油田的土壤盐度较低（0.55-0.67%）。
细菌群落结构分析
高通量测序结果显示，大庆油田和胜利油田的土壤样品中细菌群落结构存在显著差异。在门（phylum）水平上，大庆油田和胜利油田的优势菌群分别为厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和酸杆菌门（Acidobacteria）。在油泥处理后，厚壁菌门的相对丰度显著下降，而变形菌门、放线菌门和拟杆菌门（Bacteroidetes）的相对丰度显著增加。
菌属水平的变化
在属（genus）水平上，大庆油田和胜利油田的优势菌属分别为Algiphilus和Pseudomonas。油泥处理后，大庆油田的Perlucidibaca、Alcanivorax和Algiphilus等菌属显著富集，而胜利油田的Salinisphaera、Microbulbifer和Idiomarina等菌属也显著增加。这些菌属可能参与了石油烃类的降解过程。
多样性指数与PCA分析
Shannon-Wiener指数显示，油泥处理后的土壤样品细菌多样性显著降低。PCA分析表明，大庆油田和胜利油田的细菌群落结构存在显著差异，主要归因于油泥污染和采样区域的不同。
本研究通过高通量测序技术揭示了大庆油田和胜利油田老化油泥污染土壤中的细菌群落结构及其多样性。研究发现，油泥处理显著改变了土壤中的细菌群落结构，促进了变形菌门、放线菌门和拟杆菌门等具有降解潜力的菌群的富集。此外，研究还发现了一些可能参与石油烃类降解的菌属，如Alcanivorax和Pseudomonas。这些结果为开发基于土著微生物的生物修复技术提供了理论依据和数据支持。
重要发现
研究首次通过高通量测序技术系统揭示了中国两大油田老化油泥污染土壤中的细菌群落结构及其多样性，发现了多个可能参与石油烃类降解的菌属。
方法新颖性
研究采用了Illumina MiSeq高通量测序技术，能够全面、高效地分析土壤中的微生物群落结构，为类似研究提供了技术参考。
研究对象的特殊性
研究聚焦于中国两大油田的老化油泥污染土壤，具有重要的区域特色和应用价值。
研究还探讨了土壤理化性质对微生物群落结构的影响，发现土壤盐度和TOC含量是影响细菌群落结构的重要因素。这些发现为进一步优化生物修复技术提供了重要参考。
通过本研究，研究人员不仅揭示了老化油泥污染土壤中的微生物群落结构，还为开发高效、经济的生物修复技术提供了理论依据和数据支持。