猪冠状病毒感染机制研究取得重要进展：唾液酸作为关键宿主因子作用的系统解析
本研究报告由Guanghao Guo、Mengjia Zhang、Zhuojia Xu、Peng Xi、Hongmei Zhu、Anouk Evers、Robert Jan Lebbink、Yifei Lang、Qigai He、Yao-Wei Huang、Tiehai Li、Berend Jan Bosch和Wentao Li共同完成，作者单位包括华中农业大学农业微生物学国家重点实验室、上海药物研究所国家新药筛选中心、荷兰乌得勒支大学医学中心、四川农业大学、华南农业大学等机构。该研究成果于2025年9月6日发表在微生物学领域知名期刊*mBio*（第16卷第9期，文章编号10.1128/mbio.01628-25）上。
本研究属于病毒学，特别是冠状病毒宿主-病原体互作机制研究领域。猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）是严重危害全球养猪业的α冠状病毒，可导致仔猪严重水样腹泻和高死亡率。尽管已知PEDV能够与唾液酸（Sialic acid）结合，但唾液酸的具体亚型（如α2,3-连接或α2,6-连接）在感染中的确切作用、以及哪些宿主因子在PEDV利用唾液酸的过程中发挥关键作用，此前尚不完全清楚。此外，其他猪肠道冠状病毒（如猪丁型冠状病毒PDCoV、猪传染性胃肠炎病毒TGEV等）是否也依赖类似的宿主因子，也是领域内感兴趣的问题。因此，本研究旨在利用前沿的遗传筛选技术，系统性地鉴定PEDV感染所必需的宿主因子，并深入阐明唾液酸在PEDV及其他猪冠状病毒感染过程中的具体角色和作用机制。
本研究的工作流程严谨而系统，主要包含以下几个关键步骤：
首先，为了在全基因组范围内无偏倚地筛选PEDV感染的关键宿主因子，研究团队设计并执行了一项基于CRISPR/Cas9的基因敲除筛选。他们使用表达Cas9蛋白的人肝癌细胞（Huh7）作为筛选平台，利用一个包含约26万条独特向导RNA（sgRNA）的全基因组sgRNA文库对细胞进行慢病毒转导，构建了大规模基因敲除细胞池。选择Huh7细胞是因为前期研究发现高毒力PEDV GDU株（GIIb型）能在该细胞中不依赖胰酶增殖，避免了胰酶对细胞和筛选信号的干扰。筛选过程模拟了自然感染的选择压力：用低感染复数（MOI = 0.1）的PEDV GDU株对基因敲除细胞池进行连续三轮感染。感染后存活的细胞被认为可能缺失了对病毒感染至关重要的基因。研究人员收集这些存活细胞，通过下一代测序（NGS）分析其sgRNA的丰度和富集情况。通过计算存活细胞与对照细胞之间sgRNA序列频率的对数倍数变化，他们鉴定出了在病毒感染选择压力下显著富集的sgRNA及其靶向基因。
其次，基于筛选结果，研究人员选择了排名靠前的候选基因进行功能验证。他们利用稳定表达Cas9的猪肾近端小管上皮细胞（LLC-PK1）构建了针对候选基因（如ST3GAL4）的敲除（KO）细胞系。通过基因测序确认了敲除效率，例如在ST3GAL4敲除细胞中检测到了一个四碱基对的缺失。随后，用PEDV感染这些敲除细胞和野生型对照细胞，通过免疫荧光检测病毒抗原、TCID50测定病毒滴度、以及实时荧光定量PCR（qRT-PCR）定量病毒RNA拷贝数等多种方法，评估基因敲除对病毒感染的影响。为了确认表型的特异性，他们还在敲除细胞中回补表达了相应的基因（如ST3GAL4-FLAG），验证了病毒感染的恢复情况。
第三，为了系统地研究唾液酸合成通路在PEDV感染中的作用，研究团队构建了一系列唾液酸合成相关基因的敲除细胞系。这些基因包括负责将胞浆内活化的唾液酸前体CMP-Neu5Ac转运至高尔基体的转运蛋白编码基因SLC35A1，以及两类关键的唾液酸转移酶基因：ST3GAL4（催化α2,3-连接唾液酸）和ST6GAL1（催化α2,6-连接唾液酸）。他们还构建了ST3GAL4/ST6GAL1双敲除细胞。利用凝集素染色（MAL II特异性结合α2,3-唾液酸，SNA特异性结合α2,6-唾液酸）技术，他们直观地证实了这些基因敲除有效减少了细胞表面相应类型唾液酸的表达。然后，在这些敲除细胞系中进行了PEDV感染实验，评估病毒复制水平。为了探索化学抑制与基因敲除的协同效应，他们还使用了唾液酸转移酶特异性抑制剂3Fax-Neu5Ac处理细胞，并与基因敲除手段结合，观察对病毒感染的抑制效果。
第四，为了探究唾液酸影响PEDV感染的具体环节，研究团队设计了病毒吸附和内化实验。他们将野生型及各种敲除细胞在4°C条件下与病毒孵育，允许病毒结合但不内化，随后通过qRT-PCR检测结合到细胞上的病毒基因组RNA量，评估吸附效率。在内化实验中，细胞与病毒在4°C结合后，转移到37°C孵育短暂时间以启动内化，然后用酸性PBS（pH 1.3）洗去未内化的病毒颗粒，再通过qRT-PCR检测已内化的病毒RNA，评估内化效率。为了排除病毒复制步骤的干扰，他们还使用了表达PEDV Spike蛋白的假病毒系统重复了吸附和内化实验。
第五，为了在分子水平上确定PEDV Spike蛋白对不同唾液酸化聚糖（Sialoglycan）的结合偏好，研究团队进行了一项糖芯片（Glycan microarray）筛选实验。他们纯化了PEDV S1蛋白（受体结合亚基），并将其与一个包含24种合成糖脂聚糖（包括不同类型和连接方式的唾液酸结构）的芯片进行孵育，检测S1蛋白与各种聚糖的结合强度。通过分析相对荧光值，确定了S1蛋白的结合谱。
第六，为了检验研究发现的普适性，研究团队将研究范围扩展到其他重要的猪冠状病毒。他们选取了当前流行的PEDV GIIb和GIIc毒株，以及猪丁型冠状病毒（PDCoV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）和猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS-CoV），在ST3GAL4和ST6GAL1敲除的LLC-PK1细胞中测试了这些病毒的感染效率，通过免疫荧光和病毒滴度测定评估唾液酸对这些病毒的重要性。
本研究获得了系统而明确的结果。全基因组CRISPR筛选结果显示，在PEDV感染中存活细胞显著富集的sgRNA靶向的基因，主要涉及唾液酸和硫酸乙酰肝素生物合成通路以及胆固醇代谢等。其中，编码α2,3-唾液酸转移酶的ST3GAL4基因是排名最高的宿主因子之一。随后的功能验证证实了筛选结果的可靠性：敲除ST3GAL4能显著抑制PEDV在LLC-PK1细胞中的复制，表现为病毒抗原减少、病毒滴度和RNA拷贝数下降；而回补表达ST3GAL4则能完全恢复病毒感染的敏感性，证明了ST3GAL4是PEDV感染的关键宿主因子。
对唾液酸合成通路基因的系统敲除研究揭示了PEDV利用唾液酸的特性。凝集素染色证实，SLC35A1敲除几乎完全阻断了所有唾液酸的表面表达，ST3GAL4敲除主要影响α2,3-唾液酸，ST6GAL1敲除主要影响α2,6-唾液酸。感染实验发现，任何单一类型的唾液酸合成受阻（ST3GAL4 KO或ST6GAL1 KO）都会显著抑制PEDV感染，而同时阻断两者（双敲除）或阻断唾液酸合成的共同上游步骤（SLC35A1 KO）抑制效果最强。回补实验进一步证实，恢复SLC35A1或ST6GAL1的表达也能挽救病毒的感染能力。这些结果表明，PEDV能够利用α2,3-和α2,6-两种连接方式的唾液酸作为细胞附着因子（attachment factor）来促进感染。化学抑制剂3Fax-Neu5Ac能剂量依赖性地抑制病毒感染，且与SLC35A1基因敲除具有协同效应，进一步支持了靶向唾液酸合成通路作为抗病毒策略的潜力。
机制研究表明，唾液酸主要影响PEDV感染的早期步骤。病毒吸附和内化实验显示，与野生型细胞相比，ST3GAL4或ST6GAL1敲除细胞中PEDV及其假病毒的吸附和内化效率均显著降低。这说明细胞表面唾液酸的减少直接削弱了病毒与细胞的初始结合以及随后的内存作用，从而抑制了感染进程。
糖芯片筛选结果提供了更精细的结合偏好信息。PEDV S1蛋白对含有末端α2,8-Neu5Ac-α2,3-Neu5Ac表位的唾液酸化聚糖表现出最强的结合偏好，对α2,3-连接的唾液酸苷也有结合，但对α2,6-连接唾液酸苷的结合信号相对较弱。这与细胞实验观察到的PEDV可利用α2,6-唾液酸似乎存在差异。作者对此进行了解释：在细胞表面，低亲和力的聚糖（如α2,6-唾液酸）可以通过多价相互作用（multivalent interactions）来增强病毒的结合，从而在生物学上发挥重要作用，而这种作用可能在基于单一聚糖分子的芯片筛选中无法充分体现。在体内，α2,3-连接的唾液酸可能是PEDV的主要附着因子。
最后，扩展研究发现，唾液酸的作用并不局限于PEDV GDU毒株。当前流行的PEDV GIIb和GIIc毒株的感染同样依赖于ST3GAL4和ST6GAL1。更重要的是，其他几种猪肠道冠状病毒，包括PDCoV、TGEV和SADS-CoV，在唾液酸合成基因敲除细胞中的感染也受到显著抑制。这表明依赖唾液酸作为附着因子或辅助受体可能是多种猪冠状病毒共有的感染策略，具有普遍意义。
本研究的结论是：通过全基因组CRISPR筛选，首次系统性地鉴定出ST3GAL4是PEDV高效感染的一个关键宿主因子。研究证实，PEDV可以利用细胞表面的α2,3-和α2,6-两种连接方式的唾液酸作为附着因子，促进病毒的吸附和内化过程。尽管其Spike蛋白在体外对特定结构的唾液酸聚糖（如含α2,8-连接）有更高亲和力，但在细胞环境中，两种连接方式的唾液酸均能有效支持感染。此外，唾液酸对于多种猪肠道冠状病毒（PDCoV， TGEV， SADS-CoV）的高效感染也至关重要。因此，靶向唾液酸生物合成通路中的关键酶（如ST3GAL4， ST6GAL1， SLC35A1）可能为开发广谱抗猪冠状病毒感染策略提供新的思路。
本研究的亮点在于：第一，研究方法的先进性与系统性：率先将全基因组CRISPR/Cas9筛选技术应用于高毒力PEDV毒株的宿主因子鉴定中，实现了无偏倚、高通量的发现。第二，机制研究的深度与广度：不仅鉴定了关键基因ST3GAL4，还通过构建多种唾液酸通路基因敲除和回补细胞系，结合凝集素染色、化学抑制、病毒吸附/内化实验、假病毒系统以及糖芯片技术，从多个层面、立体化地阐明了唾液酸在PEDV感染中的具体作用和机制。第三，研究发现的新颖性与普适性：明确了PEDV能够“双管齐下”地利用α2,3-和α2,6-唾液酸，并首次系统性地证明唾液酸是多种猪肠道冠状病毒共用的重要感染辅助因子，拓展了对冠状病毒入侵机制的理解。第四，潜在的应用价值：揭示了唾液酸合成通路作为抗病毒药物靶点的潜力，为未来设计针对猪冠状病毒的干预措施（如开发小分子抑制剂或基因工程抗病动物）提供了重要的理论依据和候选靶标。
这项研究是冠状病毒宿主因子研究领域的一项重要进展，它不仅深化了对PEDV这一重要动物病原体感染机制的认识，也为理解其他冠状病毒与宿主的相互作用提供了新的视角，具有重要的科学意义和潜在的临床应用前景。