中国生物制品学杂志2011年2月第24卷第2期刊登了由辽宁医学院（现锦州医科大学）王书全、李明、马鸣潇团队完成的一项原创研究，题为《一种新型杂合抗菌肽在毕赤酵母中的表达及其抗菌活性》。该研究聚焦抗生素耐药性这一全球性难题，通过基因工程技术设计并表达了一种新型杂合抗菌肽，为开发替代传统抗生素的新型抗菌药物提供了重要基础。

研究背景与目标

抗生素耐药性问题日益严峻，亟需开发新型抗菌药物。抗菌肽（Antimicrobial Peptides, AMPs）因其广谱抗菌活性（包括抗细菌、抗真菌、抗病毒及抗肿瘤作用）成为研究热点。已有500多种抗菌肽被鉴定，主要分为天蚕素（ceropins）、蛙皮素（magainin）、蜂毒素（melittin）和防御素（defensin）四类。然而，天然抗菌肽存在毒性高、合成成本高等局限。因此，研究者提出通过人工设计杂合肽（hybrid peptide）优化性能：即以已知抗菌肽为蓝本，通过氨基酸替换、片段拼接等方式，构建高效、低毒、短肽链的新型抗菌肽。

本研究选择天蚕素A（cecropin A, CA）、天蚕素D（cecropin D, CD）和蜂毒素（melittin, ME）的活性片段，设计杂合肽CA(1-11)CD(12-37)ME(1-18)（简称ADM），并在毕赤酵母（*Pichia pastoris*）中表达。毕赤酵母是一种高效的真核表达系统，具备外源蛋白正确折叠、翻译后修饰及分泌表达的优势，适合规模化生产。

研究方法与流程

研究分为以下关键步骤：

1. 基因设计与合成

   • 根据GenBank中CA、CD、ME的氨基酸序列，选用毕赤酵母偏爱密码子，通过DNAStar软件设计杂合肽ADM的基因序列（198 bp）。
     
   • 在N端添加Kex2蛋白酶切割位点，C端引入终止密码子，两端设计SnaBⅠ和NotⅠ酶切位点，由宝生物工程（大连）有限公司合成基因片段。
     

2. 重组质粒构建与鉴定

   • 将ADM基因插入毕赤酵母表达载体pPIC9K（含α-factor信号肽），构建重组质粒pPIC9K-ADM。
     
   • 通过双酶切（SnaBⅠ/NotⅠ）和测序验证质粒构建正确性（图1）。
     

3. 酵母转化与筛选

   • 电转化法将pPIC9K-ADM导入毕赤酵母GS115，筛选His⁺Mut⁺表型阳性克隆。
     
   • 以酵母基因组为模板，PCR扩增验证目的基因（393 bp，含α-factor信号肽序列）（图2）。
     

4. 诱导表达与蛋白鉴定

   • 甲醇诱导表达5天，Tricine-SDS-PAGE分析显示上清液中约6.1 kDa的目的蛋白条带（图3）。
     
   • 薄层扫描显示可溶性ADM占总蛋白的13%，表明高效分泌表达。
     

5. 抗菌活性检测

   • 琼脂扩散法测试ADM对大肠杆菌（E. coli DH5α、JM109）和金黄葡萄球菌（*S. aureus*）的抑菌活性。
     
   • 结果显示：ADM对E. coli DH5α抑菌圈直径达14.8 mm（阳性对照氨苄青霉素为15.5 mm），对JM109和*S. aureus*亦有显著抑制（表1）。
     

研究结果与意义

1. 成功表达杂合抗菌肽ADM
   通过密码子优化和毕赤酵母表达系统，首次实现ADM的分泌表达，产量达菌体总蛋白的13%，为规模化生产奠定基础。

2. 验证广谱抗菌活性
   ADM对革兰氏阴性菌（*E. coli*）和革兰氏阳性菌（*S. aureus*）均有效，且毒性低于天然蜂毒素，符合“高效低毒”设计目标。

3. 技术亮点

   • 杂合肽设计策略：通过拼接CA、CD、ME的活性片段，兼具天蚕素的膜破坏能力和蜂毒素的抗菌效率。
     
   • 真核表达优化：利用毕赤酵母的翻译后修饰能力，确保ADM正确折叠与活性。
     

结论与展望

该研究首次在毕赤酵母中表达了新型杂合抗菌肽ADM，并证实其抗菌潜力。未来可通过结构优化（如缩短肽链、降低合成成本）和体内毒性测试推进临床转化。此外，毕赤酵母表达系统为其他抗菌肽的工业化生产提供了技术参考。

研究价值

• 科学价值：为抗菌肽的理性设计提供新思路，推动耐药性研究。
  
• 应用价值：ADM或成为抗生素替代候选药物，尤其在畜牧兽医（如动物饲料添加剂）和医疗领域（如伤口感染）具应用前景。
  

参考文献（略，详见原文）