本研究由江南大学（Jiangnan University）生物界面与生物检测国际联合实验室及食品科学与技术学院的李晓芳、郭玲玲、徐新新、匡华、刘丽强、胥传来和孙茂忠等人完成，发表于 *Food Chemistry*，于2025年5月7日在线发表。

研究背景
呋喃香豆素类化合物（furanocoumarins, fcs）是一类主要存在于芸香科和伞形科植物中的次级毒性代谢产物，常见于葡萄柚、芹菜等日常果蔬中。该类物质具有光毒性、肝毒性、致突变性和致癌性，对人类健康构成潜在威胁。然而，目前中国和欧盟均未制定食品中呋喃香豆素的最大残留限量（mrls），因此亟需开发高效、灵敏的检测方法。现有的仪器分析方法如高效液相色谱-串联质谱（hplc-ms/ms）、超快速液相色谱-串联质谱（uflc-ms/ms）等虽然灵敏且可同时检测多种呋喃香豆素，但设备昂贵、操作复杂、耗时长，不适用于现场大批量样品筛查。免疫分析方法具有快速、简便、灵敏等优势，但目前已有的酶联免疫吸附测定（elisa）和竞争性酶免疫测定（eia）仅能检测最多两种呋喃香豆素。因此，本研究的目标是开发一种能够同时快速检测多种呋喃香豆素的广谱免疫分析方法。

研究流程与方法
本研究首先利用量子化学分子模拟和rdkit软件对半抗原（hapten）进行设计与筛选。由于大多数呋喃香豆素分子中缺乏可直接与载体蛋白偶联的活性基团（如羧基或氨基），仅bergaptol和alloimperatorin带有羟基可直接偶联，但直接偶联会因缺少间隔臂（spacer arm）而降低偶联效率并掩盖特征结构。因此，研究者设计了两种候选半抗原fcs-hapten-1和fcs-hapten-2，分别通过在bergaptol的c10位或alloimperatorin的c7位引入含羧基的间隔臂进行衍生。通过rdkit计算dice相似性系数（dsc）和tanimoto相似性，结合gaussian 09w、multiwfn等软件进行几何优化、频率计算和波函数分析，并利用discovery studio 2024可视化分子三维构象重叠，最终确定fcs-hapten-1对八种呋喃香豆素（psoralen、isopsoralen、bergaptol、bergapten、imperatorin、isoimperatorin、alloimperatorin和oxypeucedanin）具有更高且更均匀的结构相似性。随后以bergaptol为原料，与6-溴己酸乙酯反应并经碱水解、酸化、萃取等步骤合成fcs-hapten-1，分子量为316 da，经lc-ms/ms确证。然后采用经典的活化酯法（edc/nhs）将半抗原分别与钥孔戚血蓝蛋白（klh）和牛血清白蛋白（bsa）偶联，制备免疫原fcs-hapten-1-klh和包被抗原fcs-hapten-1-bsa，并通过紫外-可见光谱（uv-vis）确认偶联成功。

在单克隆抗体（mab）制备方面，以fcs-hapten-1-klh免疫balb/c雌性小鼠，经五次免疫后取脾细胞与骨髓瘤细胞进行peg1450介导的细胞融合，通过有限稀释法亚克隆筛选获得能稳定分泌广谱抗体的杂交瘤细胞株，最终获得单克隆抗体mab 2c6。该抗体的重链亚型为igg1，轻链为kappa，亲和常数为6.48 × 10⁹ l/mol。通过间接竞争酶联免疫吸附测定（ic-elisa）建立八种呋喃香豆素的标准曲线，测得各物质的半数抑制浓度（ic50）和检出限（lod）等参数。交叉反应率（cr%）结果显示，mab 2c6对bergapten、isoimperatorin和oxypeucedanin的识别能力较强，对其他植物毒素的交叉反应率低于0.1%，表明其特异性高。

基于该抗体构建了胶体金免疫层析试纸条（cg-icts）。首先通过柠檬酸三钠还原氯金酸制备胶体金颗粒，透射电镜（tem）和uv-vis表征显示其分散性良好，特征吸收峰在523 nm。将mab与胶体金偶联后，特征吸收峰红移至528 nm，确认cg-mab偶联成功。然后对试纸条的包被抗原浓度、抗体浓度和重悬缓冲液进行优化。抗原浓度选择0.1和0.4 mg/ml，抗体浓度选择1、2、5、10 μg/ml，结果显示抗原0.1 mg/ml搭配抗体10 μg/ml时可获得较优的抑制率和显色强度。重悬缓冲液方面，碱性缓冲液+5% tw-20具有最高的抑制率，因此被选为最优条件。试纸条由pvc底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素（nc）膜和吸收垫五部分组成，nc膜上设置检测线（t线，固定包被抗原）和质控线（c线，固定羊抗鼠igg）。检测时，样品中的呋喃香豆素与t线上的包被抗原竞争结合cg-mab，阳性样品t线变浅或消失，阴性样品t线显色明显，c线始终显色作为质控。

在样品分析方面，从当地市场采集8份葡萄柚样品，经匀浆、50%甲醇水溶液提取、离心、过滤后，稀释四倍用于cg-icts分析，同时以hplc进行验证。

主要研究结果
半抗原设计阶段，通过rdkit计算发现fcs-hapten-1与八种呋喃香豆素的dice相似性系数均大于50%，且比fcs-hapten-2更均匀；tanimoto相似性热图也显示相同趋势。量子化学分析表明，fcs-hapten-1和fcs-hapten-2在特征性o14位点均保留负静电势，与八种呋喃香豆素一致，但fcs-hapten-1在不同静电势区间的表面积分布更接近呋喃香豆素。原子电荷分析显示，fcs-hapten-1在c7位电荷与除imperatorin和alloimperatorin外的六种呋喃香豆素一致，而fcs-hapten-2仅与imperatorin和alloimperatorin一致。因此，fcs-hapten-1被选为最优半抗原用于后续免疫原合成。

单克隆抗体mab 2c6对八种呋喃香豆素的ic50值分别为：psoralen 146.18 ng/ml、isopsoralen 314.84 ng/ml、bergaptol 199.84 ng/ml、bergapten 13.71 ng/ml、imperatorin 318.10 ng/ml、isoimperatorin 3.04 ng/ml、alloimperatorin 115.86 ng/ml、oxypeucedanin 0.08 ng/ml。交叉反应率中，oxypeucedanin最高达5021.11%，isoimperatorin为1096.22%，bergapten为586.9%，而bergaptol仅100%，这可能由于c10位羟基也是bergaptol的特征基团，间隔臂的引入改变了该位点附近的静电势，降低了抗体对bergaptol的识别能力。

在葡萄柚基质中，cg-icts对八种呋喃香豆素的定性检测目视检出限（vlod）分别为500、5000、2000、20、2000、5、2000和2 μg/kg，定量检出限（qlod）分别为40.17、70.05、24.79、4.24、168.91、0.53、69.42和0.14 μg/kg。加标回收实验中，oxypeucedanin在1、5、10 μg/kg三个加标水平的回收率为93.60%～106.60%，相对标准偏差（rsd）为1.14%～4.36%，与hplc结果一致。特异性测试显示，试纸条对sencionine、monocrotaline、amygdalin、coniine、colchicine和alpha-solanine等六种其他植物毒素在1000 μg/kg浓度下均无交叉反应。8份真实葡萄柚样品中，3份为阴性，3份弱阳性，2份阳性；阳性样品中均检出oxypeucedanin，hplc测定含量分别为11.86、14.27、7.38、425.87和1145.37 μg/kg，cg-icts定量结果与之高度相关（r=0.992）。稳定性实验显示，试纸条在25°c干燥密封条件下可保存180天，回收率保持在97.50%～106.00%，rsd小于10%。

研究结论与价值
本研究成功开发了一种基于广谱单克隆抗体的胶体金免疫层析试纸条，可同时快速检测葡萄柚中八种呋喃香豆素。该方法前处理简单，整个检测过程可在10分钟内完成，具有高效、便捷、低成本等优势，适用于现场大批量样品的快速筛查。研究不仅在抗体开发中引入量子化学模拟和分子相似性计算等理性设计策略，提高了广谱抗体制备的成功率，也为其他小分子污染物广谱免疫分析方法的开发提供了新思路。

研究亮点
本研究的创新点包括：（1）通过量子化学分子模拟和rdkit软件理性设计与筛选半抗原，系统比较了两种候选半抗原的结构相似性、静电势分布和三维构象重叠，最终获得对八种呋喃香豆素具有广谱识别能力的单克隆抗体；（2）建立的cg-icts可在10分钟内同时定性及定量检测八种呋喃香豆素，灵敏度高，其中oxypeucedanin的定量检出限低至0.14 μg/kg；（3）该方法应用于真实葡萄柚样品检测，结果与hplc高度一致，验证了其实际应用可靠性。此外，该试纸条在180天内保持稳定，便于储存和现场使用，为食品安全监测中呋喃香豆素类污染物的快速筛查提供了实用工具。