本研究由J. Dinithi R. Perera、Shivaji A. Thadke、Savani W. Thrikawala等来自卡内基梅隆大学化学与生物分子设计与发现研究所、印度浦那印度科学教育与研究学院、美国佐治亚州立大学以及新加坡南洋理工大学等多个机构的科研人员共同完成。研究成果以“A pothole-filling strategy for selective targeting of r(CUG)-repeats associated with myotonic dystrophy type 1”为题，于2026年1月9日发表在《美国国家科学院院刊》（PNAS）上。这是一项开放获取的原创性研究文章。
该研究的学术背景聚焦于RNA靶向治疗领域，具体针对由三核苷酸重复序列扩张引发的遗传性疾病——1型强直性肌营养不良（DM1）。DM1是最常见的成人发病型肌营养不良症，由DMPK基因中CTG重复序列的异常扩张（从正常的5-35个扩张至80个甚至超过5000个）引起。转录产生的长链CUG重复RNA会形成发夹结构，并异常结合并扣押肌肉盲样蛋白1等剪接调控因子，导致广泛的RNA剪接缺陷，这是DM1病理的核心驱动因素。现有的治疗策略，如小分子药物和反义寡核苷酸，分别面临特异性/选择性设计困难和大分子药物递送/脱靶效应等挑战。因此，开发兼具小分子尺寸和反义寡核苷酸精准识别能力的新型靶向工具至关重要。本研究旨在提出一种创新的“填坑”策略，设计并验证一类双面识别、构象预组织的短链核酸配体，以期实现对致病性长度CUG重复RNA的高特异性、高选择性靶向，并恢复正常的剪接功能。
研究的详细工作流程系统而严谨，涵盖了从理论设计、计算模拟、化学合成到体外、体内功能验证的多个环节。
第一，理性设计与分子模拟。 研究团队首先基于其开发的Janus碱基（双面碱基）和构象预组织的γ肽核酸骨架，设计了仅含三个识别单元（E/E， F， K）的短链配体（如LG1a, LG1b, LG2a, LG2b）。Janus碱基的设计旨在模块化地识别所有可能的RNA碱基对，其中第一代碱基E和第二代碱基E专门用于识别C-G碱基对（分别形成5个和6个氢键）。配体采用“双面”架构，其沃森面和克里克面分别以反平行和平行方式与RNA双链的两条链结合，实现“双面识别”。为了评估设计合理性，研究进行了分子动力学模拟。他们构建了包含四个连续结合位点的RNA双链与配体（LG1a或LG1b）的复合物模型，进行了500纳秒的模拟。结果显示，随着结合配体数量的增加，复合物稳定性增强，表现出正协同结合效应。特别是携带碱基E的LG1b比携带E的LG1a形成更稳定的氢键网络，且配体与RNA沃森链（反平行结合）的相互作用更有利，这与γPNA的特性一致。模拟结果为后续配体的优化（选择LG2系列）和实验验证提供了理论基础。
第二，化学合成与配体构建。 研究团队合成了所需的Janus碱基（E， E， F， K）及其γPNA结构单元。通过固相合成法组装了目标配体LG2a和LG2b，并进行了高效液相色谱纯化和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱表征。此外，为了改善细胞摄取，他们合成了衍生配体LG2c，即在LG2b的基础上，通过二硫键连接了一个C端的六聚精氨酸穿膜肽，以促进细胞内（细胞质和细胞核）的配体释放。所有合成配体的紫外-可见光谱特性均被测定，以确保其化学性质的均一性。
第三，体外结合特性评估。 这是验证配体功能的核心环节，采用了多种生物物理和生化技术。 * 电泳迁移率变动分析： 首先，使用EMSA评估了LG2a和LG2b与含有10个完美匹配结合位点的模型RNA双链（U10）的结合。结果显示，LG2b在生理相关条件下表现出高效结合，在配体与结合位点比例为2：1时达到完全结合，而LG2a几乎不结合，印证了分子模拟中E碱基的优越性。为了验证序列特异性，LG2b与含有单碱基错配（A-A， C-C， G-G）的RNA靶标孵育，未观察到任何结合，证明了其高度的序列识别特异性。选择性竞争实验进一步表明，LG2b仅与较长的RNA双链（如U10）结合，而不与单链RNA或短的双链（U1， U4）结合，并且在存在大量短链或单链竞争物的情况下，仍能优先结合长链靶标，展现出对长重复序列的选择性。 * 结合亲和力与协同性定量： 通过EMSA和表面等离子体共振技术定量测定了LG2b对不同长度CUG重复RNA的解离常数。结果表明，随着RNA重复序列长度增加（从U4到致病长度的rCUG98），Kd值从7.01 µM显著下降到0.56 µM，同时Hill系数从~1.6升高到~5.0，证明了强烈的正协同结合。相比之下，作为阳性对照的反义吗啉代寡核苷酸CAG25虽然对rCUG98有稍高的亲和力（Kd = 0.20 µM），但其协同性很低（n = 1.4）。更重要的是，LG2b能选择性结合致病长度的rCUG98，而对正常长度的rCUG33几乎没有结合，而CAG25对两者结合无差别。这凸显了双面配体设计在区分病理性与生理性重复长度方面的独特优势。 * 原子力显微镜直接观测： 为了从结构上直观证实结合，研究使用AFM观测了配体LG2b与模型RNA（R65）复合物的形貌。结果显示，与配体结合后，RNA双链的轮廓高度增加了约0.348 nm，达到与双链DNA对照相似的高度。这种显著的“增厚”效应与经典的沟槽结合不同，强有力地支持了配体是通过“填坑”机制插入到RNA双链的U-U错配区域，从而在结构上直接验证了其作用模式。
第四，功能竞争与细胞表型挽救。 研究进一步评估了配体在生物功能层面的效果。 * 竞争性置换MBNL1： 通过EMSA实验，测试了LG2b与MBNL1竞争结合致病性rCUG98的能力。实验设置了三种模式：置换（配体加入预形成的rCUG98-MBNL1复合物）、预防（配体先与rCUG98结合再加入MBNL1）和竞争（三者同时混合）。结果显示，在预防和竞争模式下，LG2b能有效阻止MBNL1结合，形成清晰的配体-RNA复合物带；在置换模式下也能部分置换已结合的MBNL1，但效率较低。这证明了配体能够干扰致病RNA与关键剪接因子之间的异常相互作用。 * 纠正DM1细胞剪接缺陷： 最后，研究在DM1患者来源的肌管细胞模型中测试了衍生配体LG2c的治疗潜力。将细胞与LG2c、阳性对照（锁核酸LNA和小分子药物Furamidine）或不处理对照一起孵育。通过RT-PCR分析了三个与DM1症状相关的基因（SERCA1， cTNT， IR）的剪接模式。结果表明，1 µM的LG2c能够部分恢复这些基因的正常剪接，其纠正效率与Furamidine相当，但低于需要转染试剂递送的LNA。同时，免疫荧光显示LG2c处理能显著减少细胞核内由CUG重复RNA形成的病理性核 foci。这些结果在细胞水平证明了该配体设计具有纠正DM1相关分子病理表型的潜能。
研究取得了一系列明确的结果。分子模拟证实了设计配体与靶标RNA稳定结合的可能性，并指导了优势配体（LG2b）的选择。体外结合实验的一系列数据（EMSA、SPR）共同证明，LG2b具有极高的序列特异性（不结合错配靶标）、长度选择性（优先结合长重复序列）以及强烈的正协同结合效应。AFM结构分析为“填坑”结合机制提供了直接的结构证据。功能实验则证明，LG2b能有效竞争MBNL1，而LG2c能在DM1细胞模型中部分纠正剪接缺陷并减少核 foci。这些结果层层递进，从分子识别、生物物理特性到细胞功能，完整地支撑了研究的核心结论：基于双面Janus碱基和预组织γPNA骨架的短链核酸配体，能够作为一种新型工具，高特异性和高选择性地靶向致病性CUG重复RNA，并具有纠正疾病相关表型的潜力。
本研究的主要结论是，成功开发并验证了一类创新的“填坑”式RNA靶向配体。这类配体巧妙地将小分子的紧凑尺寸与反义寡核苷酸的编程式氢键识别能力相结合，通过其独特的双面识别架构和预组织骨架，实现了对致病性长度CUG重复RNA前所未有的特异性和选择性。其意义与价值在于：科学价值方面，它提出了一种全新的RNA靶向范式（“pothole-filling”），克服了传统小分子（缺乏理性设计、特异性差）和反义寡核苷酸（需解旋RNA、脱靶风险、递送挑战）的核心局限，为靶向结构化RNA（不仅是重复序列，也包括其他具有关键生理功能的天然RNA结构）提供了通用的分子设计平台。应用价值方面，这项工作为开发治疗DM1及其他三核苷酸重复扩张疾病（如亨廷顿病、多种脊髓小脑共济失调等）的新型疗法奠定了概念验证基础。尽管细胞摄取效率仍需优化，但其设计原理展示了巨大的转化潜力。
本研究的亮点突出体现在以下几个方面：1. 设计理念新颖：“双面识别”和“填坑”机制是核心创新，通过识别RNA自身的二级/三级结构（如发夹中的错配），而非强行解旋单链，大幅提高了特异性并避免了热力学惩罚。2. 方法论综合全面：研究整合了计算化学（MD模拟）、合成化学、多种生物物理表征（EMSA， SPR， AFM）以及细胞生物学功能验证，形成了完整、严谨的证据链。3. 协同性效应显著：短配体（仅三单元）通过相邻配体间的π-π堆积等作用，产生了强烈的正协同结合，这是其能区分不同长度重复序列的关键。4. 选择性突破：能够明确区分致病性与正常长度的重复序列，这是迈向安全治疗的关键一步，避免了干扰正常基因功能的风险。
此外，研究还展示了该平台的扩展性，旨在开发涵盖16种Janus碱基的完整工具箱以识别所有RNA碱基对，预示着其在更广泛RNA靶向领域的应用前景。研究中与阳性对照（CAG25吗啉代寡核苷酸和Furamidine小分子）的详细比较，也为领域内不同技术路线的优劣提供了有价值的参考数据。