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线粒体DNA高效腺嘌呤碱基编辑的新机制与工具开发

作者及机构
本研究由Yuhang Fan、Wenchao Xu、Bao-Qing Gao等共同完成，通讯作者为Jia Chen（上海科技大学）。合作机构包括上海科技大学基因编辑中心、复旦大学附属儿科医院分子医学中心、中国科学院上海营养与健康研究所等。论文于2025年2月21日在线发表于Nature Biotechnology，标题为《Leveraging base excision repair for efficient adenine base editing of mitochondrial DNA》。

学术背景

研究领域：线粒体DNA（mtDNA）碱基编辑技术。
研究动机：mtDNA突变与多种遗传性线粒体疾病（如Leigh综合征、MELAS等）相关，其中超过40%的致病突变为G-to-A或C-to-T，理论上可通过A-to-G编辑修复。然而，传统CRISPR碱基编辑器因向导RNA难以递送至线粒体而失效。2023年开发的TALEDs（转录激活因子样效应器连接脱氨酶）虽能实现mtDNA的A-to-G编辑，但其机制不明，效率受限。
科学问题：TALEDs如何实现A-to-G编辑？如何通过机制解析提升编辑效率与精准度？

研究流程与实验设计

1. TALEDs工作机制解析

研究对象：
- Split TALED（stTALED）：包含分裂的ddDA（双链DNA特异性胞苷脱氨酶）和TadA8e（单链DNA特异性腺苷脱氨酶）。
- 细胞模型：野生型（WT）和基因敲除（KO）的293FT细胞（如UNG/SMUG1双敲、HMGB1敲除等）。

实验方法：
- 体外脱氨实验：纯化stTALED蛋白，检测其对双链DNA（dsDNA）或单链DNA（ssDNA）的脱氨活性。
- 关键发现：
- 依赖碱基切除修复（BER）：ddDA介导的C-to-U脱氨触发BER通路，UDG（尿嘧啶DNA糖基化酶）切除尿嘧啶，形成AP位点，经HMGB1加工后暴露ssDNA区域，供TadA8e催化A-to-I脱氨。
- 旁观编辑（bystander editing）机制：若ssDNA形成于非TadA8e结合的TALE区域，TadA8e仍可结合另一条链的dsDNA区域，导致非目标位点编辑。

2. 高效TALEDs开发

策略：
- 增强ddDA活性：用高活性变体ddDA6替换原始ddDA，构建stTALED6，编辑效率提升2-3倍。
- 融合hUNG：将人源UDG（hUNG）与TadA8e融合，进一步促进尿嘧啶切除，构建eTALEDs（如eTALED6），效率提升1.3-3.2倍。

验证实验：
- 多靶点测试：在ND1、ND5.1等mtDNA位点比较原始TALED与eTALEDs的编辑效率，eTALED6在ND1位点效率达72.45%（原始TALED为33.41%）。
- 单细胞分析：在A549和U2OS细胞中验证工具普适性。

3. 精准度优化

工程化TadA8e：引入R111S或V28R突变缩小编辑窗口，构建eTALED6R。
结果：
- 减少脱靶：eTALED6R的mtDNA-wide脱靶编辑与原始TALED相当，但目标位点编辑效率保持48.88%（ND5.4位点）。
- 转录组安全性：RNA脱靶编辑数量显著降低（如eTALED6R的A-to-I变异数比原始TALED减少60%）。

4. 致病突变建模应用

目标突变：m.A13514G（导致Leigh综合征/MELAS的D393G氨基酸替换）。
结果：
- eTALED6R成功引入突变（效率48.88%），且纯目标等位基因占比达35.48%（原始TALED仅7.48%）。
- 功能验证：编辑后细胞线粒体耗氧率（OCR）下降，模拟疾病表型。

主要结果与逻辑链条

1. 机制解析：通过体外实验和基因敲除细胞模型，证明TALEDs依赖BER通路而非DNA解旋，颠覆了“ddDA介导DNA解旋”的原有假设。
   
2. 工具开发：基于机制，通过增强BER（ddDA6+hUNG）提升效率，eTALED6在ND1位点效率提升116%。
   
3. 精准化改进：TadA8e工程化使eTALED6R兼具高效率和低脱靶，目标/非目标编辑比提升26倍（DNA水平）和60倍（RNA水平）。
   
4. 应用验证：成功构建致病突变模型，为线粒体疾病研究提供新工具。
   

结论与价值

科学意义：
- 首次阐明TALEDs通过BER通路实现mtDNA编辑的分子机制，为优化基因编辑工具提供理论依据。
- 开发的eTALED6系列工具在效率、精准度和安全性上显著超越原始版本，填补了mtDNA碱基编辑的技术空白。

应用前景：
- 疾病建模：可高效引入致病突变，加速线粒体疾病机制研究与药物筛选。
- 基因治疗潜力：未来或可修复mtDNA突变，但需解决递送挑战。

研究亮点

1. 机制创新：揭示BER是TALEDs编辑的核心通路，提出“ddDA触发→UDG/HMGB1介导ssDNA形成→TadA8e编辑”的级联模型。
   
2. 工具突破：eTALED6系列通过“增强BER+缩小窗口”双策略，实现效率与精准度的协同优化。
   
3. 跨学科方法：整合结构生物学（ddDA活性改造）、酶工程（TadA8e突变）和功能基因组学（全转录组脱靶分析）。
   

其他价值

• 技术普适性：在多种人类细胞系（293FT、A549、U2OS）中验证工具有效性。
  
• 安全性数据：eTALED6R未显著增加核基因组突变或细胞毒性，为临床转化奠定基础。
  

（全文约2000字）