主要作者及单位： 本研究由天津医科大学总医院骨科的Wenlu Yuan、Pengtian Zhao、Wenyuan Shen等人（共同第一作者）以及通讯作者Shiqing Feng和Zhishuo Wang领衔完成。Shiqing Feng的单位还包括山东大学第二医院骨科和齐鲁医学院骨科研究中心。该研究成果已被《International Journal of Biological Macromolecules》接收，并于2026年以预校样（Journal Pre-proof）形式在线发表。
研究背景： 脊髓损伤（Spinal Cord Injury, SCI）是一种由创伤或疾病引起的严重神经系统疾病，常导致运动、感觉和自主神经功能障碍，目前缺乏有效的再生治疗策略。损伤后，以M1型巨噬细胞为主导的急性炎症反应会释放大量促炎因子（如肿瘤坏死因子α, TNF-α；诱导型一氧化氮合酶, iNOS）和活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS），造成继发性组织损伤。因此，促进巨噬细胞从促炎的M1表型向抗炎的M2表型极化，被认为是减轻炎症、营造有利于神经修复微环境的关键。丹酚酸B（Salvianolic acid B, Sal B）是从丹参中提取的一种生物活性多酚，在脑和脊髓损伤模型中显示出神经保护潜力，但其存在水溶性高、体内代谢快、难以透过血脑屏障等缺陷。本研究旨在开发一种新型的可3D打印、蓝光交联的明胶甲基丙烯酰基（GelMA）/丝素蛋白（Silk Fibroin）复合水凝胶载药系统，以实现Sal B的高效负载与持续定点释放，并探究该系统对脊髓损伤后神经保护、抗炎及功能恢复的作用与机制。
研究流程与详细方法： 本研究的工作流程涵盖了材料制备与表征、体外细胞实验、体内动物模型验证以及转录组测序分析四个主要阶段。
第一阶段：Sal B水凝胶的制备与理化表征 研究者首先从蚕茧中提取丝素蛋白，将其溶解于高浓度盐酸胍溶液中使其蛋白骨架展开。随后，将变性的丝素蛋白与GelMA按1:1的质量比混合，并加入光引发剂三联吡啶氯化钌和共引发剂过硫酸铵，制备成可打印的生物墨水。通过蓝光照射引发GelMA的甲基丙烯酰基聚合和丝素蛋白的双酪氨酸交联，形成互穿网络水凝胶。为克服Sal B因自由基清除作用抑制光聚合的难题，本研究采用了一种创新的后载药策略：先制备空白水凝胶，再将其浸泡于Sal B溶液中达到药物负载平衡。通过该方法制备了低剂量（0.5 mg/mL）和高剂量（1 mg/mL）两种Sal B水凝胶（Sal B Gel）。此外，还通过酰胺化反应和湿法研磨制备了Sal B@丝素蛋白纳米颗粒，用于增强药物的缓释效果。
在表征方面，研究团队运用了多种技术： * 3D打印性：利用配备405 nm蓝光固化模块的3D生物打印机，成功打印出多种复杂形状的结构，证实了墨水优异的可打印性和形状保真度。 * 微观结构：扫描电子显微镜观察显示，随着Sal B的加载，水凝胶网络孔径减小，结构更致密。 * 力学性能：振荡流变仪测试表明，Sal B水凝胶在整个频率范围内储能模量始终高于损耗模量，表现出典型的粘弹性固体行为，且自组装网络赋予其更优的机械完整性和能量耗散能力。 * 稳定性与降解性：水凝胶在不同pH（4.0, 6.0, 7.4）和温度下孵育一周均能保持结构完整；大鼠皮下植入14天后，仍有约50%的凝胶残留。 * 药物释放：高效液相色谱法测定显示，Sal B水凝胶具有缓释特性，而包载Sal B的丝素蛋白纳米颗粒进一步增强了缓释效果。 * 构象分析：远紫外圆二色光谱揭示了Sal B的引入和盐酸胍介导的变性-交联过程，增强了丝素蛋白链的分子间相互作用，诱导了更有序的分子构象。
第二阶段：体外细胞实验评估神经保护与抗炎效果 * 研究对象与处理：采用HT22小鼠海马神经元细胞系，通过过氧化氢刺激模拟脊髓损伤后的氧化应激微环境。实验分为对照组、过氧化氢处理组、过氧化氢+空白凝胶组及过氧化氢+Sal B凝胶组。 * 活性氧检测：使用DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS水平。结果表明，Sal B凝胶组能显著降低过氧化氢诱导的ROS，展现出优异的抗氧化能力。 * 神经元保护：使用活/死细胞染色和3D共聚焦成像，证实HT22细胞能在Sal B凝胶中良好粘附、增殖和分布，保持高活性。 * 抗炎作用：采用脂多糖刺激大鼠骨髓来源的巨噬细胞建立炎症模型。蛋白质印迹分析表明，Sal B凝胶处理可显著降低炎症标志物TNF-α和iNOS的蛋白表达水平。 * 巨噬细胞极化调控：这是本研究的关键体外机制验证。通过流式细胞术和免疫荧光染色，分析M1型巨噬细胞表面标志物CD86和M2型标志物CD206的表达。结果显示，Sal B凝胶处理显著抑制了脂多糖诱导的M1型极化（CD86阳性细胞比例下降），同时促进了向M2型（CD206阳性细胞比例上升）的转变，证实其能有效调控炎症微环境。
第三阶段：体内大鼠脊髓损伤模型验证 * 动物模型与分组：采用成年雌性Wistar大鼠，在T10节段使用NYU打击器建立标准的脊髓挫伤模型。实验共设六组：假手术组、损伤组、空白凝胶组、低剂量Sal B凝胶组、高剂量Sal B凝胶组（药物浓度1.0 mg/mL）及每日腹腔注射Sal B药物组，每组样本量为6只。损伤后立即在损伤部位原位植入对应水凝胶，或开始腹腔给药。 * 亚急性期（术后7天）的神经保护与抗炎机制研究： * 免疫荧光染色：对损伤部位脊髓切片进行染色，结果显示，与损伤组相比，Sal B凝胶组显著增加了神经元核抗原阳性（NeuN⁺）的存活神经元数量，并上调了M2型巨噬细胞标志物精氨酸酶-1 (Arg-1)的表达，同时下调了iNOS的表达。 * 蛋白质印迹分析：定量分析进一步证实，Sal B凝胶能显著降低iNOS和TNF-α的蛋白水平，并显著增加Arg-1的表达。更重要的是，该研究揭示了其潜在机制：Sal B凝胶组的PI3K/AKT信号通路关键蛋白，包括AKT1、磷酸化PI3K和磷酸化AKT的表达水平均显著上调，表明Sal B水凝胶通过激活PI3K/AKT通路发挥抗炎和神经保护作用。 * 长期（术后8周）功能恢复评估： * 运动功能评分：采用BBB评定量表在术后多个时间点（最长至56天）进行双盲评估。Sal B凝胶组大鼠的后肢运动功能恢复最为显著，评分远高于损伤组和腹腔注射药物组。 * 电生理检测：术后56天通过运动诱发电位评估神经传导功能。Sal B凝胶组的波形潜伏期更短，波幅更高，表明其神经信号传导效率的恢复最优。 * 步态分析：利用CatWalk步态分析系统客观评价。Sal B凝胶组大鼠的平均速度、规律性指数等参数最接近假手术组，足印模式和四肢支撑时序图也显示其协调性恢复最佳。 * 组织学评估：八周后的免疫荧光染色显示Sal B凝胶组促进了更多神经丝蛋白200阳性的轴突再生，并抑制了胶质纤维酸性蛋白阳性的星形胶质细胞过度增生。苏木精-伊红（H&E）染色证实Sal B凝胶有效减小了脊髓空洞面积，且对心、肝、脾、肺、肾等主要脏器无明显毒性。
第四阶段：转录组测序（RNA-seq）分析 为深入探究分子机制，研究者对损伤邻近区域的脊髓组织进行了RNA-seq。差异基因分析显示，与单纯损伤组相比，Sal B凝胶组有202个基因显著变化。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析明确指出，这些差异基因显著富集于PI3K/AKT信号通路（校正P值<0.01）。基因本体论（GO）分析也支持了促存活和抗炎过程的激活。这从全转录组水平再次验证了Sal B凝胶通过调控PI3K/AKT通路发挥治疗作用的分子机制。
研究结论与价值： 本研究成功开发了一种新型的、可3D打印的蓝光光交联GelMA/丝素蛋白水凝胶递药系统，通过独特的“变性-重折叠”策略，实现了对具有自由基清除活性的丹酚酸B的高效负载与持续释放。该水凝胶材料在体外能有效抑制氧化应激和炎症，并诱导巨噬细胞向M2抗炎表型极化。在大鼠脊髓损伤模型中，Sal B凝胶通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路，显著减轻神经炎症、保护神经元、促进轴突再生并缩小脊髓空洞，最终实现了运动、电生理和步态功能的显著恢复。其疗效远优于腹腔注射Sal B。
科学价值与应用价值： 该研究为脊髓损伤的再生修复提供了全新的治疗策略，将天然多酚药物的生物活性与先进的生物材料工程技术巧妙结合。它不仅证实了“生物材料调控损伤微环境”这一理念的可行性，还为解决易代谢、难递送药物的临床应用瓶颈提供了范例。3D打印的可定制性使其有望在未来实现针对不同患者脊髓损伤病灶形态的个性化精准治疗，具有重大的临床转化潜力。
研究亮点： 1. 独特的药物负载策略：创新性地使用盐酸胍预变性丝素蛋白，展开其β-折叠结构，通过离子交换和增强的静电作用，在一步法内同时实现基质疏松化和药物高效负载，解决了多酚类化合物抑制自由基光聚合的难题。 2. 多功能的递送平台：该系统集可3D打印性、形状自适应性、蓝光交联、药物缓释和生物降解性于一体，能完美填充不规则损伤空腔。 3. 明确的机制探索：从细胞、蛋白到转录组水平，系统地揭示了Sal B水凝胶通过抑制ROS、促进M2型巨噬细胞极化和激活PI3K/AKT通路来发挥神经保护和功能修复作用的完整机制链条。 4. 显著的体内疗效：多种功能性评估（BBB评分、电生理、CatWalk步态）系统性地证实了该水凝胶在促进脊髓损伤后功能恢复方面的显著优势，尤其是原位移植效果远超传统系统给药。