本研究的通讯作者为沈华浩（Huahao Shen）、鞠振宇（Zhenyu Ju）和应颂敏（Songmin Ying）。沈华浩和应颂敏教授来自浙江大学医学院附属第二医院呼吸与危重症医学科、呼吸疾病研究所、浙江省呼吸疾病诊治及研究重点实验室。鞠振宇教授来自杭州师范大学医学院衰老研究所（Leibniz衰老研究所干细胞衰老合作研究组）以及暨南大学再生医学教育部重点实验室、衰老与再生医学研究院。其他主要作者包括张超（Chao Zhang）、易薇（Weiwei Yi）等。该研究于2018年1月12日在线发表于学术期刊《Cell Research》（细胞研究）（2018年，第28卷，323-335页）。
这项研究属于免疫学与血液学、干细胞生物学的交叉领域。长久以来，嗜酸性粒细胞（eosinophil, Eos）被认为是终末效应细胞，主要与过敏性疾病的免疫反应、寄生虫感染防御以及组织损伤有关。近年来的研究逐步揭示嗜酸性粒细胞具有更广泛的免疫调节功能，例如参与骨髓中浆细胞的维持和B细胞的分化。然而，嗜酸性粒细胞是否参与调节造血干细胞（hematopoietic stem cell, HSC）的稳态，仍然是一个未知的领域。造血干细胞是维持机体终身造血功能的关键，其稳态（包括静息状态、增殖、分化和自我更新能力）受到骨髓微环境中多种细胞和因子的精密调控。任何破坏这种稳态的因素都可能导致造血功能异常，甚至衰竭。本研究旨在探索在过敏性炎症等嗜酸性粒细胞增多的条件下，嗜酸性粒细胞是否以及如何影响造血干细胞的稳态，并阐明其潜在的分子机制。
本研究的工作流程系统而严谨，综合运用了多种遗传工程小鼠模型、疾病诱导模型、细胞生物学、分子生物学和蛋白质组学技术。研究流程可以概括为以下几个主要阶段：
第一阶段：构建模型并观察表型。研究首先构建了两种主要的嗜酸性粒细胞增多模型。第一种是卵清蛋白（ovalbumin, OVA）诱导的野生型小鼠过敏性气道炎症模型。通过腹腔注射OVA致敏，然后进行雾化吸入激发，成功诱导了气道炎症，并伴随外周血、骨髓和脾脏中嗜酸性粒细胞数量的显著增加（补充材料图S1a）。第二种是利用CD3δ启动子驱动IL-5表达的转基因小鼠（IL-5 tg），该小鼠由于T细胞特异性过表达IL-5，导致体内持续存在极高水平的嗜酸性粒细胞。同时，研究者还使用了嗜酸性粒细胞过氧化物酶（EPO）启动子驱动白喉毒素A亚基（DTA）表达的转基因小鼠（Eos-null），该小鼠完全缺乏嗜酸性粒细胞。通过这些模型，研究者可以比较在嗜酸性粒细胞存在（WT+OVA， IL-5 tg）或缺失（Eos-null）的情况下，造血干细胞的状态。
第二阶段：评估造血干细胞稳态。研究者通过流式细胞术系统分析了骨髓和脾脏中的造血干细胞和祖细胞群。他们将Lin⁻Sca-1⁺c-Kit⁺细胞定义为LSK细胞（富含HSC），并进一步根据CD34和Flk2标记物区分长期造血干细胞（LT-HSC）、短期造血干细胞（ST-HSC）和多能祖细胞（MPP）。在OVA诱导的野生型小鼠中，他们观察到骨髓中LSK细胞、LT-HSC、ST-HSC、MPP以及各系祖细胞（特别是粒/单核祖细胞GMP）的绝对数量显著增加。通过BrdU掺入实验，发现这些小鼠骨髓中的LT-HSC增殖比例升高。然而，从这些小鼠骨髓中分选出的单个LT-HSC在体外进行的集落形成单位（CFU）实验却显示，其形成大集落和中集落的能力显著下降。此外，这些小鼠还出现脾脏肿大，脾脏中LSK细胞数量也增多。这表明OVA诱导的炎症虽然促进了HSC的扩增和动员（从骨髓迁移至脾脏），但可能损害了其功能（自我更新或长期重建能力）。相反，在IL-5 tg小鼠中，研究者观察到了更极端的表型：骨髓中的HSC和祖细胞池（包括LT-HSC、ST-HSC、MPP和各系祖细胞）出现显著耗竭，而脾脏中的HSC则大量扩增。这提示持续的嗜酸性粒细胞增多可能导致骨髓HSC库的衰竭和异常外迁。
第三阶段：确认嗜酸性粒细胞的关键作用。为了确认上述表型是由嗜酸性粒细胞直接引起的，研究者进行了关键的遗传学“拯救”实验。他们将IL-5 tg小鼠与Eos-null小鼠杂交，获得双转基因小鼠（IL-5 tg & Eos-null）。这种小鼠血清中IL-5水平仍然很高，但完全缺乏嗜酸性粒细胞。结果显示，在嗜酸性粒细胞缺失的情况下，IL-5 tg小鼠骨髓中耗竭的HSC数量和脾脏肿大表型均恢复到与野生型小鼠相似的水平（图2h-k， 补充图S4）。同样，在OVA诱导的Eos-null小鼠中，HSC的异常扩增和脾肿大也得到显著缓解（补充图S3）。这些结果有力地证明了，无论是在急性过敏性炎症还是慢性嗜酸性粒细胞增多状态下，对HSC稳态的破坏作用都是嗜酸性粒细胞依赖性的。
第四阶段：探索分子机制——从表型到候选因子。为了理解嗜酸性粒细胞如何损害HSC功能，研究者首先进行了体外共培养实验。他们将从野生型小鼠分离的HSC与从IL-5 tg小鼠分离的嗜酸性粒细胞共培养2小时后，再进行单个HSC的CFU实验。结果显示，共培养后的HSC形成大/中集落的能力下降，证实嗜酸性粒细胞可以直接在体外损害HSC功能。此外，迁移实验表明嗜酸性粒细胞能促进HSC的迁移。为了寻找介导这一效应的分子，研究者对从WT、IL-5 tg和Eos-null小鼠骨髓分选出的LSK细胞进行了RNA-seq分析。生物信息学分析发现，IL-5 tg小鼠的HSC中，氧化磷酸化（OXPHOS）通路相关基因显著上调，而抗氧化基因表达下调，提示HSC内可能存在氧化还原（redox）失衡和活性氧（ROS）水平升高。这一推测随后被流式细胞术使用DCFH-DA探针检测细胞内ROS水平所证实：无论是体外与嗜酸性粒细胞共培养的HSC，还是从IL-5 tg或OVA处理小鼠体内分离出的HSC，其ROS水平均显著升高（图3）。重要的是，在嗜酸性粒细胞缺失的IL-5 tg小鼠中，HSC内升高的ROS水平也恢复了正常。
接下来，研究的关键一步是鉴定嗜酸性粒细胞分泌的、导致HSC内ROS升高的具体因子。研究者采用了基于质谱的定量蛋白质组学策略，分析了WT、IL-5 tg和Eos-null小鼠骨髓上清液中的分泌蛋白。通过对总共2790个鉴定到的蛋白质进行分析，重点关注了30个分泌蛋白，其中23个被定义为细胞因子/趋化因子。分析结果突出显示，趋化因子CCL-6在IL-5 tg小鼠的骨髓上清中水平显著升高（图4a）。后续实验进一步确认，在IL-5 tg和OVA处理的小鼠中，CCL-6主要由嗜酸性粒细胞表达和分泌，而非中性粒细胞（图4b-e）。ELISA检测也证实，IL-5 tg小鼠血清中CCL-6水平极高，而这种升高在嗜酸性粒细胞缺失后被基本消除（图4c）。
第五阶段：验证CCL-6的关键作用。为了证明CCL-6是连接嗜酸性粒细胞与HSC功能损害的关键效应分子，研究者设计了一系列功能获得和功能缺失实验。首先，他们在体外用针对CCL-6的小干扰RNA（siRNA）转染嗜酸性粒细胞，敲低其CCL-6表达，然后再与HSC共培养。结果显示，敲低CCL-6后，嗜酸性粒细胞诱导的HSC内ROS水平升高得到缓解，HSC的异常迁移也被抑制（图4f, g）。其次，他们使用了CCL-6的假定受体CCR1的特异性抑制剂BX471。在共培养体系中加入BX471，同样能够阻断嗜酸性粒细胞引起的HSC内ROS积累（图4h）。最后，也是最具说服力的体内实验，研究者给IL-5 tg小鼠或OVA处理的小鼠注射了CCL-6特异性中和抗体。在IL-5 tg小鼠中，连续一周给予CCL-6中和抗体后，骨髓中耗竭的HSC和祖细胞数量得到显著恢复，脾脏中异常增多的HSC则受到抑制（图5b-e）。在OVA处理的小鼠中，给予CCL-6中和抗体同样能够恢复骨髓中HSC的数量，并显著改善从这些小鼠分离的LT-HSC的体外集落形成能力（图5f, g）。
第六阶段：意外发现——CCL-6在炎症中的双重角色。在验证CCL-6对HSC功能影响的同时，研究者意外发现，在OVA诱导的气道炎症模型中，使用CCL-6中和抗体虽然“拯救”了HSC功能，却加剧了肺部炎症。具体表现为：支气管肺泡灌洗液（BALF）中炎症细胞总数、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞数量进一步增加；肺组织匀浆中Th2相关细胞因子IL-33水平升高；肺组织病理切片（H&E和PAS染色）显示炎症细胞浸润和粘液分泌更加严重（补充图S7）。这表明，嗜酸性粒细胞来源的CCL-6在过敏性气道炎症中扮演了一个抑制炎症的角色。因此，CCL-6在体内可能具有双重功能：一方面，它作为炎症负调控因子，抑制过度的嗜酸性粒细胞炎症；另一方面，它通过升高HSC内的ROS水平，损害HSC的稳态和功能。
本研究的主要结果层层递进，逻辑严密。第一步的表型观察揭示了嗜酸性粒细胞增多与HSC稳态紊乱（功能损害或衰竭）之间的关联。第二步的遗传学拯救实验确立了这种关联的因果关系，即“嗜酸性粒细胞是导致HSC损害的必要条件”。第三步的机制探索，通过RNA-seq和ROS检测，将问题聚焦到HSC内的氧化还原失衡。第四步的蛋白质组学分析成功筛选出关键介质CCL-6，并证实其来源于嗜酸性粒细胞。第五步的体外和体内功能验证，通过敲低、抑制剂和中和抗体等多种手段，最终确立了“嗜酸性粒细胞→分泌CCL-6→作用于HSC（可能通过CCR1受体）→引起ROS水平升高→损害HSC稳态和功能”这条完整的信号轴。第六步的意外发现，进一步丰富了CCL-6的生物学功能图谱，揭示了其在免疫调节和干细胞稳态间的复杂平衡作用。
本研究的结论是：嗜酸性粒细胞通过分泌趋化因子CCL-6，破坏造血干细胞的氧化还原稳态，导致细胞内活性氧水平升高，进而损害造血干细胞的自我更新和长期重建能力，最终可能引致造血干细胞库的衰竭。这一发现揭示了一种此前未知的、由成熟免疫细胞（嗜酸性粒细胞）反向调控上游干细胞（造血干细胞）稳态的新机制，即“Eos/CCL-6/ROS轴”。同时，研究还发现CCL-6在过敏性气道炎症中具有抗炎作用，这提示该分子在体内可能扮演着平衡免疫反应强度与维持造血系统稳定的双重角色。
这项研究的科学价值在于：首先，它极大地拓展了人们对嗜酸性粒细胞功能的认识，将其从传统的终末效应细胞提升为能够深刻影响造血系统根基（HSC）的关键调节细胞。其次，它揭示了连接炎症/免疫系统与干细胞生物学的一个崭新分子桥梁（CCL-6），为理解慢性炎症、过敏性疾病与造血功能异常（如血细胞减少或衰竭）之间的潜在联系提供了新的理论框架。第三，它强调了ROS作为关键信号分子，在介导微环境因素对HSC功能影响中的核心作用。其应用价值在于，为治疗某些与嗜酸性粒细胞增多相关的血液系统疾病（例如某些骨髓衰竭综合征或骨髓增殖异常）提供了潜在的新靶点（如CCL-6或其受体CCR1）。同时，研究发现的CCL-6在炎症中的抑制功能，也暗示了在开发抗炎疗法时，需要权衡其对造血系统可能产生的副作用。
本研究的亮点突出：第一，重要的科学发现：首次揭示了嗜酸性粒细胞及其分泌的CCL-6对造血干细胞稳态的负向调控作用，并阐明了ROS介导的分子机制，这是一个概念上的重要突破。第二，严谨的研究设计：综合利用了多种互补的体内模型（OVA炎症模型、IL-5 tg组成性模型、Eos-null缺失模型）和遗传学杂交“拯救”实验，从正反两方面无可辩驳地证明了嗜酸性粒细胞的关键作用。第三，先进的技术整合：研究流程有机整合了前沿的蛋白质组学（质谱定量分析）、转录组学（RNA-seq）、高分辨率流式细胞术和单细胞功能分析（单细胞CFU），从全局筛选到精准验证，技术路线清晰高效。第四，意外的双重功能揭示：不仅回答了主要科学问题，还意外发现了CCL-6在炎症中的抗炎作用，增加了研究的深度和复杂性，使其生物学意义更加丰满。第五，明确的临床相关性：研究将过敏性炎症这一常见病理状态与造血干细胞功能直接联系起来，为理解慢性疾病对全身系统性健康的影响提供了新视角。
此外，研究中详实的补充材料（Supplementary Information）提供了大量的方法学细节和辅助数据，例如流式分析设门策略（图S2）、不同模型中嗜酸性粒细胞的具体变化（图S1, S4）、ROS产生的线粒体来源证据（图S5f）以及CCL-6在不同组织腔室中的细胞来源定量分析（图S6b, d-f）等，这些都极大地增强了研究的可靠性和可重复性，为同行深入理解和验证该工作提供了坚实基础。这项发表于《Cell Research》的研究是一项高质量、具有开创性的工作，对免疫学、血液学和干细胞生物学领域均产生了重要影响。