本文发表于 *nature biotechnology*，通讯作者为 V. Narry Kim（Institute for Basic Science 和 Seoul National University），第一作者包括 Soo-Jin Jung、Jenny J. Seo 和 Sunghan Lee。研究团队主要来自韩国首尔的基础科学研究院 RNA 研究中心和首尔大学。

研究背景

信使 RNA（mRNA）疗法和疫苗的核心挑战之一是 mRNA 在体内的稳定性不足。传统线性 mRNA 在进入细胞质后会迅速被脱腺苷酸化和降解，导致蛋白表达时间短。环状 RNA（circRNA）和自扩增 RNA 等替代形式虽然稳定性更高，但存在翻译效率低、与碱基修饰不兼容或生产困难等问题。此外，之前发现的某些病毒 RNA 稳定元件在 N1-甲基假尿苷（m1ψ）修饰的 mRNA 中大多失去活性，而 m1ψ 修饰正是降低免疫原性、提高 mRNA 疗效的关键策略。因此，本研究旨在从病毒基因组中筛选出能够在 m1ψ 修饰背景下显著增强 mRNA 稳定性和翻译效率的 RNA 元件。

研究流程

研究从构建大规模病毒序列文库开始。团队收集了感染脊椎动物的病毒基因组，涵盖 337 个病毒种、297 个病毒属，最终生成了 196,277 个长度为 197 nt、步长为 20 nt 的病毒序列片段（tiling oligos）。这些片段被分成两个亚库，分别克隆到 EGFP 报告基因的 3′ 非翻译区（3′ UTR），并通过 PA01 整合酶系统整合到 HEK293T 细胞中，进行初步筛选。通过两轮流式细胞术分选 GFP 高表达的细胞，富集能增强蛋白输出的序列。随后从分选细胞中提取基因组 DNA，扩增病毒片段并重新克隆到萤火虫荧光素酶报告基因的 3′ UTR，构建用于二级筛选的质粒库。以该库为模板合成含 m1ψ 的 IVT mRNA，并用脂质纳米颗粒（LNP）转染 HCT116 细胞，在 0 小时和 36 小时收集细胞，通过 RT-PCR 和测序评估各片段的 RNA 稳定性。二级筛选最终得到 131 个显著增强 m1ψ 修饰 mRNA 稳定性的片段，这些片段聚成 11 个簇，命名为 a1 至 a11。

随后，团队对这些候选元件进行了验证和机制研究。他们对 a1–a11 的原始 197 nt 片段和更短的核心片段（a1s–a11s）进行了荧光素酶表达测试，发现其中五个元件（a1、a2、a4、a6、a7）在 m1ψ 修饰下保留超过 60% 的活性，其余元件活性减弱或失活。为解析这些元件的关键序列和结构特征，团队对活性最强的五个元件（a1s、a2、a4、a6、a7）进行了深度突变分析，共合成 4,542 个突变寡核苷酸，包括单碱基替换、单碱基或双碱基缺失、补偿性突变、环区插入和双碱基替换，并以混合文库形式构建 mRNA，在 HCT116 细胞中通过测序评估突变效应。结果显示，除 a7 外，其余元件均含有一个保守的 CNGGN 五元环或 CNGG 四元环结构；a7 则具有不同的分支茎环结构，其内部环区的“AGACCY”基序和茎环 2 的“GGGGNARUD”基序对其功能至关重要。

在机制层面，团队利用 TENT4 抑制剂 RG7834 和 ZCCHC14/ZCCHC2 敲除细胞，发现所有 11 个元件的稳定性增强作用均依赖 TENT4。除 a7 外，其余含 CNGG 基序的元件均依赖 ZCCHC14 作为 TENT4 的辅因子。a7 在两种辅因子敲除细胞中均保持活性，说明它可能通过未知的适配蛋白招募 TENT4。通过高分辨率 poly(A) 尾分析（HIRE-PAT）和纳米孔直接 RNA 测序，团队证实这些元件能够促进 poly(A) 尾的延伸和“混合加尾”，从而抵抗脱腺苷酸化介导的降解。

在功能验证阶段，团队测试了候选元件在不同细胞类型（HepG2、A549、MCF7、THP1、Jurkat、HeLa）中的活性，发现 a2 和 a7 具有最广泛和最强的跨细胞系活性。a7s 在 m5C 修饰下仍保持功能，而其他元件则失活。与商业 mRNA 疫苗的 3′ UTR 相比，a7s 在第 3 天和第 5 天的蛋白表达分别高出 17–65 倍和 78–114 倍。团队还在不同 5′ UTR、不同密码子优化策略和不同编码序列的 mRNA 中验证了 a7 的活性，发现它均能显著提高蛋白产量。

主要结果

研究发现，a7 元件能赋予线性 mRNA 与环状 RNA 相当的稳定性，同时保持更高的翻译效率。在 HepG2 和 HCT116 细胞中，含 a7s 的线性 mRNA 半衰期分别为 15.9 小时和 19.0 小时，与环状 RNA 的 15.1 小时和 19.5 小时相当，而对照线性 mRNA 仅为 6.0 小时和 6.2 小时。在蛋白输出方面，a7s 线性 mRNA 的总蛋白产量（AUC）比环状 RNA 高 5.3 倍和 5.8 倍。

在小鼠体内实验中，含 a7s 的线性 mRNA 经 LNP 静脉注射后，第 1 天的荧光素酶信号分别比对照线性 mRNA 和环状 RNA 高约 7 倍和 108 倍；第 3 天差异进一步扩大到 380 倍和 688 倍。a7s 组的表达持续到第 13 天，第 14 天仍可在肝脏中检测到信号。

结论与价值

本研究通过大规模筛选发现了一类新型 RNA 稳定性增强元件，其中 a7 表现尤为突出。a7 通过促进 TENT4 介导的混合加尾延长 poly(A) 尾，从而抵抗脱腺苷酸化降解，使线性 mRNA 获得与环状 RNA 相当的半衰期，同时保留帽依赖性翻译的高效率。a7 与 m1ψ 和 m5C 碱基修饰兼容，在不同细胞类型、不同递送方式、不同 5′ UTR 和编码序列背景下均保持活性。在体内，a7 可实现至少两周的持续蛋白表达。由于线性 mRNA 的生产工艺比环状 RNA 和自扩增 RNA 更简单、更易放大，a7 为开发更高效、更持久的 mRNA 疗法和疫苗提供了具有重要应用价值的新工具，尤其适用于肝脏和 T 细胞相关的基因治疗与免疫治疗。

研究亮点

本研究的亮点包括：系统筛选了 196,277 个病毒序列片段，覆盖面远超以往；发现并验证了 11 个 RNA 稳定性增强元件；揭示了这些元件依赖 TENT4 混合加尾的共性机制；发现 a7 是一个不依赖已知 TENT4 辅因子的独特元件；证明了 a7 能在线性 mRNA 中实现与环状 RNA 相当的稳定性，同时具有更高的翻译效率和更简单的生产工艺。