学术研究报告：Optineurin通过促进轴突线粒体递送实现神经保护与轴突再生
一、 作者、机构与发表信息 本研究由以斯坦福大学医学院眼科系Byers眼科研究所Spencer视觉研究中心的Yang Hu（通讯作者）和Zdenek Lansky（通讯作者）为首的多国研究团队完成。合作机构包括捷克科学院生物技术研究所、加州大学戴维斯分校、加州大学圣地亚哥分校、加州大学旧金山分校等。研究成果以题为“Optineurin-facilitated axonal mitochondria delivery promotes neuroprotection and axon regeneration”的论文形式，于2025年发表在《自然-通讯》（*Nature Communications*）期刊上。
二、 研究背景与目的 本研究聚焦于神经科学和神经退行性疾病领域，具体关注肌萎缩侧索硬化症（ALS）和正常眼压性青光眼（NTG）的共同致病基因——视神经蛋白（Optineurin, OPTN）。OPTN基因突变与家族性和散发性ALS及NTG密切相关，表明这两种中枢神经系统（CNS）轴突病变通过OPTN介导的机制在发病机理上存在关联。尽管OPTN作为线粒体自噬（mitophagy）的选择性自噬受体功能已被广泛研究，但其功能障碍如何导致CNS神经退行性变的具体分子机制尚不明确，部分原因在于缺乏由OPTN突变诱导的动物神经退行模型。
线粒体是细胞的能量工厂，其通过氧化磷酸化产生大部分ATP，对神经元的生长、存活、功能和再生至关重要。在神经元胞体合成后，线粒体需要被顺向（anterograde）运输到轴突中，以满足轴突的高能量需求并缓冲轴突钙离子。轴突线粒体递送不足是阿尔茨海默病、亨廷顿病、ALS和青光眼等多种神经退行性疾病动物模型的早期共同特征。轴突顺向线粒体运输机制涉及衔接蛋白TRAK1，它通过线粒体外膜蛋白Miro1与微管马达蛋白Kinesin-1家族（KIF5A-C）连接。有趣的是，OPTN也已知通过多个结合伙伴协调细胞内囊泡运输，但此前尚未被证实与线粒体轴突运输直接相关。
因此，本研究旨在：1）建立与临床相关的OPTN功能障碍导致的神经退行动物模型；2）揭示OPTN在CNS轴突病变中的新功能与分子机制；3）探索基于此机制的神经保护与轴突再生治疗策略。
三、 详细研究流程与方法 本研究是一项综合性、多层次的探索，从构建动物模型、表征表型、机制探索到治疗验证，流程环环相扣。
流程一：构建并表征神经元特异性OPTN C端截断（OPTNδC）小鼠模型。 1. 研究对象与处理：利用两种策略在小鼠视网膜神经节细胞（RGC）和/或脊髓运动神经元中特异性表达OPTNδC。策略一：向OPTN条件性敲除（floxed）小鼠玻璃体腔内注射携带RGC特异性启动子（msncg）驱动的Cre重组酶的腺相关病毒（AAV），在RGC中特异性删除OPTN基因的第12外显子，产生缺失两个C端泛素结合结构域（UBAN和ZF）的截断蛋白。策略二：将OPTN floxed小鼠与在谷氨酸能神经元（包括RGC和脊髓运动神经元）中表达Cre的Vglut2-Cre小鼠杂交，获得转基因小鼠品系（OPTNf/f::Vglut2-cre）。 2. 实验与方法： * 形态学与功能学评估：使用活体光学相干断层扫描（OCT）监测视网膜神经节细胞复合体（GCC）厚度；使用图形视网膜电图（PERG）评估RGC电生理功能；使用视动跟踪反应（OKR）测量视觉灵敏度；测量眼内压（IOP）。 * 组织学分析：在不同时间点取视网膜铺片，用RGC标记物RBPMS免疫染色并计数存活的RGC胞体；取视神经（ON）横截面，进行对苯二胺（PPD）染色并计数存活的轴突。 * 运动功能评估：对OPTNf/f::Vglut2-cre小鼠及其对照进行握力测试、旷场测试和转棒测试，评估ALS样运动缺陷。 3. 数据分析：通过对比实验组与对照组的OCT厚度、PERG振幅、OKR视力、IOP、RGC/轴突存活数量以及运动行为学参数，进行统计学分析（如t检验、ANOVA），以确定OPTNδC是否导致进行性神经退行。
流程二：探究OPTNδC导致神经退行的早期细胞表型——轴突线粒体缺陷。 1. 研究对象：上述AAV-Cre诱导的OPTNδC RGC模型小鼠，在神经退行发生显著之前（如注射后2周）进行研究。 2. 实验与方法： * 多方法量化轴突线粒体： * 荧光标记：AAV介导RGC表达线粒体靶向的Scarlet荧光蛋白（4xmts-Scarlet）。 * 活体染料标记：玻璃体腔内注射可固定、膜电位依赖的Mitotracker Orange染料，标记健康线粒体。 * 超微结构分析：对视神经横截面进行透射电子显微镜（TEM）成像，直接计数轴突内的线粒体数量。 * 线粒体自噬评估：使用AAV介导表达pH敏感性荧光蛋白mt-Keima，通过红绿荧光比值分析线粒体自噬水平。 * 其他细胞器运输评估：通过标记细胞质荧光蛋白、逆行示踪剂霍乱毒素B亚基（CTB）、溶酶体（LAMP1）、内体（Rab5）和突触小泡（Synapsin），评估一般轴突运输是否受影响。 3. 数据分析：定量分析视神经不同节段（近端、中段、远端）的线粒体密度、线粒体自噬信号强度以及其他细胞器的运输情况，并与对照组比较。
流程三：鉴定OPTN在轴突线粒体运输中的相互作用蛋白与分子机制。 1. 研究对象：培养的HEK293T细胞、原代小鼠海马神经元、以及AAV介导在RGC中表达特定蛋白的小鼠。 2. 实验与方法： * 体内邻近标记（TurboID）：在RGC中表达OPTN-TurboID融合蛋白，通过生物素化标记并富集与OPTN空间邻近的蛋白，然后进行液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析，系统筛选OPTN的相互作用蛋白。 * 免疫共沉淀（Co-IP）：在HEK293T细胞或小鼠视网膜组织中，过表达不同组合的标签蛋白（如GFP-TRAK1， HA-KIF5B， HA-OMP25标记的线粒体），通过免疫沉淀验证OPTN与TRAK1、KIF5B以及线粒体之间的直接相互作用，并检测OPTNδC是否影响这些结合。 * 体外重构运动性分析：这是本研究的关键创新方法。使用纯化的重组蛋白（mNeonGreen标记的OPTN/OPTNδC、mCherry标记的TRAK1、KIF5B）和固定在盖玻片上的微管，在严格控制的体外环境中，实时观察并量化蛋白质复合体在微管上的结合、解离和运动行为。参数包括结合密度、迁移事件频率、运行长度、运行时间和速度。 * 细胞与组织成像： * 在原代海马神经元中共表达EGFP-OPTN和线粒体染料（MitoDsRed）或线粒体外膜标记（OMP25-mCherry），使用超分辨率显微镜（SIM）观察OPTN与微管（Spy555-Tubulin染色）及线粒体的共定位。 * 进行活细胞成像，追踪轴突中线粒体和OPTN的共迁移行为，并量化线粒体运动参数。 * 对新鲜分离的小鼠视神经进行外植体培养和活体成像，直接观察并比较OPTNδC与对照视神经中线粒体的运动性。 * 人工智能结构预测：使用AlphaFold2预测OPTN及OPTNδC与微管蛋白α-tubulin的相互作用界面和置信度。 3. 数据分析：整合质谱数据、Co-IP条带强度定量、体外运动性分析的各项动力学参数、共定位定量分析以及活体成像的运动轨迹分析，构建OPTN在轴突线粒体运输中的功能模型。
流程四：验证增强线粒体运输能否挽救OPTNδC诱导的神经退行。 1. 研究对象：OPTN floxed小鼠，通过玻璃体腔共注射AAV-Cre（诱导OPTNδC）和AAV介导的KIF5B和/或TRAK1（过表达）。 2. 实验与方法：在诱导OPTNδC的同时，过表达KIF5B和TRAK1以增强线粒体运输复合体。随后，重复流程一和流程二中的部分实验：评估轴突线粒体密度（Mitotracker标记）、OCT测量的GCC厚度、PERG和OKR视觉功能、以及组织学上的RGC和轴突存活率。 3. 数据分析：比较“OPTNδC + 空载体”组与“OPTNδC + KIF5B/TRAK1”组的各项指标，验证救援效果。
流程五：探究OPTN/TRAK1/KIF5B通路在高眼压青光眼模型中的神经保护作用及在视神经损伤后的促再生作用。 1. 研究对象： * 高眼压青光眼模型：使用硅油诱导的高眼压（SOHU）小鼠模型。 * 视神经损伤模型：对小鼠进行视神经钳夹（ONC）损伤。 2. 实验与方法： * 高眼压模型：首先确认SOHU模型早期是否存在轴突线粒体运输缺陷（方法同流程二）。然后，在诱导高眼压的同时，向玻璃体腔注射AAV介导的OPTN、TRAK1和KIF5B（单独或联合）。评估其对轴突线粒体运动性、GCC厚度、视觉功能（PERG， OKR）以及RGC/轴突存活的保护作用。 * 视神经再生模型：在ONC后，向玻璃体腔注射AAV介导的OPTN/TRAK1/KIF5B。同时，与已知的强大促再生因子PTEN缺失进行对比和组合。使用CTB-Alexa 555进行顺行示踪，在损伤后特定时间点（如14天）对视神经进行全组织透明化处理，通过光片荧光显微镜或共聚焦显微镜成像，量化从损伤部位向远端再生的轴突数量及延伸距离。 3. 数据分析：量化并比较不同治疗组在高眼压下的神经保护程度，以及在ONC后的轴突再生长度和数量。分析OPTN/TRAK1/KIF5B与PTEN缺失通路之间是独立、叠加还是协同作用。
四、 主要研究结果 结果一：OPTN C端截断（OPTNδC）成功诱导了迟发性、神经元自主性的RGC和脊髓运动神经元退行，建立了与临床相关的NTG样和ALS样小鼠模型。 * 在RGC特异性OPTNδC小鼠中，活体OCT显示GCC从注射后6-8周开始进行性变薄。PERG振幅和OKR视力显著下降，但眼内压正常，这与人类NTG特征一致。组织学证实RGC胞体和视神经轴突从2-4周开始出现显著丢失并逐渐加重。 * 在OPTNf/f::Vglut2-cre小鼠中，同样观察到进行性GCC变薄和视力下降。更重要的是，这些小鼠在12周龄时出现体重增加、握力下降、运动活动减少和转棒性能受损等ALS样运动功能障碍。组织学分析证实了脊髓腹角大型运动神经元的丢失。 * 逻辑关系：这些结果首次建立了由神经元内在OPTN C端功能缺失导致的、具有明确NTG和ALS表型的动物模型，为后续机制研究提供了关键工具。
结果二：轴突线粒体显著减少是OPTNδC诱导神经退行的早期且特异性的先驱事件。 * 在神经退行发生前（2周），通过三种独立方法（AAV-4xmts-Scarlet， Mitotracker Orange活体染色， TEM）均一致发现，OPTNδC视神经中的总线粒体密度或健康线粒体数量急剧下降，而RGC胞体内的线粒体标记未见明显差异。 * mt-Keima实验显示OPTNδC并未显著影响RGC的线粒体自噬水平。同时，细胞质蛋白、CTB、溶酶体、内体和突触小泡的轴突运输也未受影响。 * 逻辑关系：这表明OPTNδC导致的缺陷是轴突线粒体运输/递送的特异性障碍，而非普遍的轴突运输或线粒体降解问题。这直接将研究焦点引向OPTN在线粒体轴突运输中的潜在新功能。
结果三：OPTN直接与线粒体运输复合体TRAK1/KIF5B及微管相互作用，并以C端依赖的方式将运输复合体锚定于微管，促进长距离线粒体运输。 * 相互作用鉴定：体内TurboID筛选将TRAK1鉴定为OPTN的邻近蛋白。Co-IP实验证实OPTN与TRAK1、KIF5B以及线粒体（通过OMP25）存在直接相互作用，且OPTNδC仍能结合TRAK1-KIF5B-线粒体复合体，说明C端不参与此结合。 * 微管结合：体外实验和细胞成像显示，全长OPTN能直接结合微管，而OPTNδC完全丧失此能力。AlphaFold2预测也支持OPTN C端与α-tubulin的直接互作。 * 功能机制——体外重构：在只有KIF5B和TRAK1时，复合体可在微管上运动。加入全长OPTN后，OPTN通过其C端“栓系”在微管上，与TRAK1-KIF5B结合，显著增加了复合体在微管上的“着陆”频率和迁移事件，并延长了运行长度/时间（速度略有下降），起到了稳定运输复合体、促进长距离运输的作用。而加入OPTNδC后，由于失去微管锚定能力，不仅不能发挥功能，反而可能“劫持”TRAK1-KIF5B-线粒体复合体，使其更难结合微管，从而减少了迁移事件。 * 功能验证——细胞与组织：在神经元中，OPTN与线粒体共定位并共迁移。OPTNδC神经元的轴突线粒体运动速度增加但运行长度和移动线粒体比例下降，与体外结果一致。新鲜分离的OPTNδC视神经中运动线粒体也显著减少。 * 逻辑关系：这些结果揭示了OPTN在轴突线粒体运输中的全新分子机制：它作为“适配器-稳定器”，通过C端结合微管，通过其他区域结合TRAK1-KIF5B-线粒体复合体，从而将运输复合体稳定在微管轨道上，促进有效的顺向运输。OPTNδC失去了微管锚点，导致该功能丧失甚至产生显性负效应，最终造成轴突线粒体递送不足。
结果四：过表达TRAK1/KIF5B增强线粒体运输复合体，可挽救OPTNδC导致的轴突线粒体缺陷和神经退行。 * 在OPTNδC小鼠的RGC中共同过表达KIF5B和TRAK1，能显著增加视神经中的线粒体密度。 * 该处理有效阻止了OPTNδC引起的GCC变薄、PERG和OKR功能下降，并显著提高了RGC胞体和轴突的存活率。单独过表达TRAK1也有一定效果。 * 逻辑关系：这一“功能获得性”救援实验从反面证明了，OPTNδC的致病核心是损害了由TRAK1/KIF5B介导的轴突线粒体运输。通过外源性增强该运输机器，可以克服OPTN功能缺失带来的危害，实现了神经保护。
结果五：轴突线粒体运输缺陷是高眼压青光眼的共同特征，OPTN/TRAK1/KIF5B过表达能有效防止高眼压导致的神经退行，并促进视神经损伤后的轴突再生。 * 在SOHU高眼压青光眼模型早期，视神经轴突线粒体的总数、运动速度和移动时间均显著下降，静止时间增加。同时，视神经头部和视网膜中内源性OPTN蛋白水平下降。 * 过表达OPTN（单独或与TRAK1/KIF5B联合）能逆转这些线粒体运输缺陷，并在高眼压持续存在的情况下，显著保护GCC厚度、视觉功能以及RGC和轴突的存活。 * 在ONC模型中，过表达OPTN/TRAK1/KIF5B能促进强大的视神经轴突再生，其效果与删除著名抑制因子PTEN相当。重要的是，OPTNδC或删除KIF5B并不影响PTEN缺失诱导的再生，而OPTN/TRAK1/KIF5B与PTEN缺失联合产生了更强的协同再生效果，表明二者通过独立且互补的途径发挥作用。 * 逻辑关系：这将OPTN机制从遗传性疾病（NTG/ALS）扩展到更常见的获得性损伤（高眼压、机械损伤），表明轴突线粒体递送不足是多种CNS轴突病变的共同瓶颈。增强此通路不仅具有神经保护潜力，还具有强大的促再生能力。
五、 研究结论与价值 本研究得出以下核心结论： 1. 机制发现：OPTN是一个全新的轴突线粒体运输促进因子。它通过C端依赖的方式结合微管，并通过C端非依赖的方式结合TRAK1-KIF5B-线粒体复合体，起到“栓系和稳定”作用，从而促进有效的顺向轴突线粒体运输，确保轴突获得充足的能量供应。 2. 致病机制：OPTN C端截断或功能障碍（如某些ALS/NTG相关突变）导致其丧失微管锚定能力，破坏线粒体运输复合体在微管上的稳定加载，造成轴突线粒体递送严重不足，这很可能是其诱发神经退行的关键分子机制。 3. 模型价值：成功构建了神经元自主性、表型明确的OPTNδC小鼠模型，为研究NTG和ALS的轴突病理及测试疗法提供了有价值的工具。 4. 治疗策略：增强由OPTN/TRAK1/KIF5B构成的线粒体运输通路，是一种有效的神经保护和轴突再生策略。该策略对遗传性（OPTN突变）和获得性（高眼压、创伤）的CNS轴突病变均具有潜在广谱治疗价值。
六、 研究亮点 1. 机制创新性：首次将OPTN与轴突线粒体运输直接联系起来，发现了其独立于自噬功能的全新角色，为理解ALS和青光眼的发病机制开辟了新视角。 2. 研究系统性：从构建疾病模型、表征早期表型、利用前沿技术（TurboID， 体外重构， AlphaFold2）揭示分子机制，到在多种体内模型（遗传、高眼压、创伤）中进行功能挽救和疗效验证，研究设计完整，逻辑链条严密。 3. 方法先进性：采用高度可控的体外重构运动性分析，直接、定量地揭示了OPTN在微管上调控TRAK1/KIF5B复合体动力学的物理化学机制，证据确凿。 4. 转化潜力大：研究不仅解释了疾病原因，更直接提出了通过增强线粒体运输来实现神经保护和再生的治疗概念，并提供了OPTN/TRAK1/KIF5B这一具体的分子工具组合，具有明确的转化医学意义。
七、 其他有价值的内容 本研究还提示，OPTN可能作为TRAK1/KIF5B复合体的一个“方向特异性效应器”，优先促进顺向运输。此外，研究对比了OPTNδC与以往报道的OPTN点突变（如E50K）模型，指出C端截断可能产生更严重或加速的表型，为理解不同突变类型的病理差异提供了线索。这些都为后续更深入的研究指明了方向。