基于支架引导的类器官形态发生构建稳态微型肠道
一、 研究团队与发表信息
本研究由瑞士洛桑联邦理工学院（École Polytechnique Fédérale de Lausanne， EPFL）Matthias P. Lutolf教授（通讯作者）团队主导，联合了荷兰乌得勒支大学Hubrecht研究所的Hans Clevers教授等团队共同完成。研究成果以题为“Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis”的论文形式，于2020年9月24日发表在《自然》（*Nature*）期刊的第585卷上。
二、 学术背景与研究目的
本研究属于组织工程、干细胞生物学和类器官技术的交叉领域。传统的三维（3D）基质培养的肠道类器官，虽然具有巨大的疾病建模潜力，但其发育是随机的，形成的是封闭的囊状结构。这种结构限制了组织的寿命和尺寸，阻碍了实验操作（如腔内给药、清除碎片），并且难以实现类似体内的稳态平衡和细胞类型空间分布。
研究团队旨在解决传统肠道类器官的这些根本局限性。他们假设，可以利用细胞固有的自组织能力，通过提供适当的物理和生化引导，将干细胞引导形成更接近体内生理结构的开放管状组织。具体目标包括：1）构建具有开放、可灌注管腔的微型肠道；2）实现类似体内隐窝-绒毛轴的细胞命运空间模式化；3）延长组织寿命，建立长期稳态培养体系；4）提高细胞类型的多样性，包含稀有细胞类型；5）使该系统能够用于宿主-微生物相互作用等长期研究。
三、 详细研究流程与方法
本研究构建了一个集成了微流控芯片、生物材料支架和干细胞技术的“芯片上类器官”平台，其核心流程如下：
1. 微流控芯片与生物活性支架的构建： * 设备设计： 研究团队设计并制造了一种弹性聚合物（PDMS）微流控芯片。该芯片核心是一个中央水凝胶腔室，两侧是用于基底侧培养基供给的储液池，两端则是用于腔内灌注的入口和出口储液池。这种设计允许从基底侧和管腔侧（顶端）独立供给营养因子和物质。 * 支架材料： 为了引导细胞生长，团队开发了一种混合水凝胶，由75%的I型胶原蛋白（提供相对坚硬的粘附基底）和25%的Matrigel（提供基底膜关键成分）组成。这种混合基质既能为细胞粘附、增殖和分化提供必要的生化信号，又具有足够的刚度，可以将细胞生长限制在预定义的形状内。 * 微通道成型： 在中央水凝胶腔内，使用激光烧蚀技术，雕刻出一个具有体内小鼠小肠隐窝几何形状的微通道。这个通道贯穿整个水凝胶腔室，形成了后续上皮组织生长的模板。
2. 微型肠道（Mini-gut）的构建与培养： * 细胞来源与接种： 研究使用来自Lgr5-EGFP报告基因小鼠的肠道干细胞（ISCs），以及从人小肠活检样本和气管组织分离的原代干细胞/祖细胞。将类器官消化成的单细胞悬液，通过入口灌注到激光雕刻的微通道中，细胞在通道内（特别是隐窝状凹槽处）沉降并粘附。 * 培养与分化： 初始使用富含生长因子（EGF, Noggin, R-Spondin 1, CHIR99021, Valproic acid）的ISC扩增培养基。待上皮单层形成后（约2-3天），通过管腔灌注切换到不含Wnt和组蛋白去乙酰化酶抑制剂的“分化培养基”，同时基底侧培养基中的生长因子浓度也逐渐降低，以诱导细胞分化。 * 灌注系统维持稳态： 这是实现长期培养的关键。团队通过一个外部泵系统或手动操作，每隔12小时对管腔进行一次灌注，冲走脱落至管腔的死亡细胞。这种持续的“清理”功能，模拟了体内肠道的蠕动清除作用，避免了死细胞堆积导致的组织退化，使得组织寿命可延长至一个月以上。
3. 组织表征与分析： 研究采用多种技术对构建的微型肠道进行了全面表征： * 显微成像： 使用延时显微镜、共聚焦显微镜观察组织形态形成、细胞增殖（EdU标记）和损伤修复过程。通过荧光染色标记特定蛋白（如Sox9、Lysozyme、L-FABP、Chromogranin A、Muc2等），鉴定干细胞、潘氏细胞、肠上皮细胞、肠内分泌细胞和杯状细胞等。 * 组织学与超微结构分析： 对组织进行切片，进行阿尔新蓝染色观察黏液层。使用透射电子显微镜（TEM）观察细胞的超微结构，如微绒毛形成的刷状缘和分泌囊泡。 * 功能检测： 通过向管腔灌注荧光标记的右旋糖酐（FITC-dextran）检测上皮屏障完整性。使用底物L-丙氨酸-4-硝基苯胺盐酸盐检测刷状缘氨基肽酶的活性，评估组织的吸收功能。 * 单细胞RNA测序（scRNA-seq）： 对培养10天和20天的微型肠道细胞，以及传统的3D Matrigel类器官细胞进行scRNA-seq分析。通过无监督聚类和已知的细胞类型标记基因，系统比较了不同培养体系中各种肠道上皮细胞类型（干细胞/祖细胞、分裂细胞、肠上皮细胞、潘氏细胞、杯状细胞、簇细胞、肠内分泌细胞等）的比例和转录组特征。 * 再生能力测试： 通过三种模型测试组织的再生潜能：(1) 使用紫外激光在特定位置造成精确上皮损伤；(2) 在管腔内灌注右旋糖酐硫酸钠（DSS，一种诱导结肠炎的细胞毒性化合物）；(3) 用γ射线照射模拟辐射损伤。通过活细胞成像追踪损伤后组织的修复过程。 * 宿主-微生物互作建模： 将微小隐孢子虫（*Cryptosporidium parvum*）的卵囊或子孢子通过入口接种到微型肠道的管腔中，建立长期感染模型。通过活细胞成像、免疫荧光染色、TEM和scRNA-seq分析，观察寄生虫的完整生命周期、组织反应以及宿主细胞的转录组变化。 * 多细胞整合： 尝试在水凝胶基质中共同培养内皮细胞、巨噬细胞或肌成纤维细胞，探索构建包含免疫细胞或间质细胞的更复杂体系。
四、 主要研究结果
1. 成功构建开放、可灌注且具有空间模式的管状微型肠道： 研究证实，混合水凝胶支架能有效引导小鼠和人的肠道干细胞形成连贯、紧密排列的单层上皮管。该管道两端开放，允许流体灌注和物质交换。更重要的是，免疫荧光染色显示，细胞类型沿着管长轴呈现了类似体内的空间分布：Sox9阳性的干细胞/祖细胞和Lysozyme阳性的潘氏细胞集中在类似隐窝的区域；而L-FABP阳性的肠上皮细胞、Chromogranin A阳性的肠内分泌细胞和Muc2阳性的杯状细胞则主要位于管道的中央区域，类似于绒毛区。EdU标记证实增殖活动主要局限于隐窝样区域。
2. 灌注系统实现长期稳态培养： 实验表明，如果不进行管腔灌注，脱落细胞在6-10小时内就会在管腔内堆积，几天内导致组织破坏。而通过定期灌注移除死细胞，微型肠道可以维持稳定的组织解剖结构和Lgr5+干细胞生态位超过一个月，实现了细胞出生与死亡的平衡，无需机械传代。
3. 微型肠道展现出接近体内的细胞多样性和功能： * scRNA-seq分析揭示： 与传统类器官相比，稳态微型肠道保留了更高比例的干细胞/祖细胞（约50% vs. 15%），并且从第10天到第20天，细胞比例从干细胞/祖细胞向肠上皮细胞逐渐转变，表明组织在成熟。微型肠道中包含了传统类器官中罕见或缺失的细胞类型，特别是微皱褶细胞（M细胞） 样细胞和绒毛顶部肠上皮细胞。肠内分泌细胞的比例（约5%）也更接近体内水平，而传统类器官中该比例极低（约0.3%）。 * 功能验证： 组织学显示有刷状缘和黏液层形成。氨基肽酶活性检测证实了其消化功能，且活性在诱导分化后稳步上升并维持平台期。
4. 微型肠道具有显著的再生潜力： 激光损伤、DSS化学损伤和γ射线辐射损伤实验均表明，微型肠道能够有效再生。例如，激光造成的上皮缺损可在32小时内被周围细胞迁移填补而修复。在低剂量辐射（2 Gy）后，组织虽经历增殖细胞耗竭和上皮破坏，但能逐渐再上皮化并重建新的隐窝结构。这证明了该体系可用于研究损伤与再生过程。
5. 成功建立长期寄生虫感染模型： 感染实验证明，微型肠道支持微小隐孢子虫完成其全部生命周期（从卵囊到新的卵囊），感染可持续至少四周而不损害组织完整性。scRNA-seq分析揭示了感染后广泛的干扰素-α反应，且该反应分布于所有细胞类型。这为研究宿主-寄生虫长期相互作用和免疫应答提供了前所未有的平台。
6. 初步实现多细胞体系共培养： 实验证明，可以在水凝胶基质中成功整合内皮细胞、巨噬细胞和肌成纤维细胞。例如，共培养的巨噬细胞表现出形态变化并摄取上皮细胞排出的颗粒，显示了细胞间的功能交流。
五、 研究结论与意义
本研究成功开发了一种通过“支架引导的类器官形态发生”来构建稳态“芯片上微型肠道”的新策略。该策略将生物工程（定制化微流控芯片和仿生基质）与干细胞的自组织能力相结合，克服了传统类器官的封闭性、短寿命和缺乏空间组织等关键限制。
其科学价值在于：1）提供了一个更接近体内肠道解剖结构和细胞组成（包括稀有细胞类型）的体外模型；2）通过灌注实现了长期稳态培养，允许研究组织稳态维持和长期动态过程（如慢性感染）；3）展示了强大的再生能力，可用于损伤修复机制研究；4）证明了其作为宿主-病原体相互作用研究平台的实用性。
应用价值巨大：这种开放、可访问且高度可控的3D组织模型，为药物发现（更生理相关的药物筛选和毒性测试）、疾病建模（如炎症性肠病、感染性疾病、癌症）、基础生物学研究（细胞命运决定、组织模式形成、再生）以及未来的再生医学提供了强大的新工具。作者指出，通过调整水凝胶支架的特性（成分、几何形状、硬度等），该策略可广泛适用于肺、肝、胰腺等其他器官的类器官构建。
六、 研究亮点
七、 其他有价值的内容
研究还展示了该平台的通用性：使用相同策略，成功利用小鼠胆管细胞、人小肠干细胞和人气管干细胞构建了相应的管状上皮组织（胆管管和气管管），并且气管管成功实现了气-液界面培养。这强有力地证明了“支架引导”策略具有普适性，可推广至其他管状上皮器官。此外，文中详细描述了微流控芯片的制造、水凝胶的配制、激光烧蚀参数、细胞培养的具体条件等，为其他实验室重复和拓展这项工作提供了详尽的技术参考。