这篇由 Ingrid M. Esteves， Haoran Chang， Adam R. Neumann， Jianjun Sun， Majid H. Mohajerani 和 Bruce L. McNaughton 等研究者共同完成的研究论文，发表在*The Journal of Neuroscience*期刊上，于2021年1月13日正式出版。研究团队主要来自加拿大莱斯布里奇大学的加拿大行为神经科学中心以及美国加州大学尔湾分校。这项研究聚焦于神经科学领域，特别是学习和记忆的神经机制，旨在探讨大脑新皮层（Neocortex）如何在空间中编码信息，以及海马体（Hippocampus）在这一过程中所扮演的关键角色。

研究背景 长久以来，海马体及其周边区域（如内嗅皮层）被认为是大脑中形成“认知地图”的核心，其中的位置细胞（Place Cells）在动物处于特定位置时放电，构成了空间记忆的神经基础。然而，近年来，随着双光子钙成像（Two-photon calcium imaging）等技术的应用，越来越多的证据表明，在包括后顶叶皮层、压后皮层和视觉皮层在内的多个新皮层区域，也存在着神经元表现出类似位置细胞的空间调制活动。这引发了一个根本性问题：新皮层中广泛存在的这种空间表征是独立形成的，还是依赖于海马体的输入来组织和维持的？换言之，海马体是否作为一个“索引”或“组织者”，协调并巩固了分布在整个新皮层的空间信息？本研究正是为了直接验证这一假说而设计的。研究团队假设，如果海马体对于新皮层空间表征的整合至关重要，那么损伤海马体将导致这些皮层神经元空间选择性的破坏或削弱。他们的研究目标包括：1）系统地调查小鼠背侧新皮层多个区域中空间编码神经元的分布和特性；2）评估海马体双侧损伤对这些皮层空间表征的形成和精度的影响。

研究设计与详细工作流程 本研究采用了一个精心设计的实验范式，结合了在体双光子钙成像技术和海马体损伤模型，工作流程可分为以下几个主要步骤：

1. 实验动物准备与手术：

   • 研究对象与样本量：研究使用了8只成年转基因Thy1-GCaMP6s小鼠，这些小鼠在其兴奋性神经元中特异性地表达钙离子指示蛋白，便于进行钙成像。这些小鼠被随机分为两组：对照组（4只）和海马体损伤组（4只）。
   • 颅窗植入：所有小鼠均接受手术，在头骨上方（覆盖背侧皮层区域）植入一个直径5毫米的透明颅窗，以便后续进行大范围的双光子成像。手术中准确标记了前囟点（Bregma），作为后续成像区域定位的解剖学参考。
   • 海马体兴奋性毒素损伤：在损伤组小鼠中，于植入颅窗前，使用纳米注射器向双侧海马背侧特定坐标点注射NMDA（一种兴奋性毒素），以特异性损毁该区域的神经元。手术后给予药物以防止癫痫发作。对照组小鼠则未进行此损伤操作。研究后期通过组织学染色验证了损伤的有效性和范围，确认损伤组小鼠海马背侧形成了广泛的神经元/组织缺失。

2. 行为训练与实验设置：

   • 小鼠在恢复后进入水限制期，以利用蔗糖水作为奖励来驱动其行为。
   • 实验在一个头固定的跑步机装置上进行。跑步机皮带长150厘米，上面固定了多种触觉线索（如热胶条、反光胶带、魔术贴），作为动物在虚拟空间中的地标。动物需要在这条皮带上奔跑以获取定期（每圈一次）的液体奖励。
   • 通过光学编码器实时监测皮带的运动，从而精确获取小鼠在皮带上的位置信息。

3. 双光子钙成像数据采集：

   • 成像方法：使用双光子显微镜，通过颅窗对小鼠浅表层皮层（第II/III层）的神经元活动进行成像。激光波长设定为920纳米，成像视野为835×835微米。
   • 系统化区域扫描：为了全面调查背侧新皮层，研究者将颅窗覆盖的区域划分为一个网格（16个区域）。他们在每只小鼠身上进行了16场记录，每场记录对应网格中的一个子区域，每次记录持续5-10分钟。成像在动物熟悉跑步机任务至少一个月后进行。
   • 区域定义：根据网格位置，将成像区域归类为五个主要的新皮层区域进行分析：压后皮层（Retrosplenial Cortex， RSC）、次级运动皮层（Secondary Motor Cortex， M2）、初级运动皮层（Primary Motor Cortex， M1）、后顶叶皮层（Posterior Parietal Cortex， PPC）和初级躯体感觉皮层（Primary Somatosensory Cortex， S1）。

4. 数据分析流程：

   • 图像预处理与神经元信号提取：使用Suite2P软件套件进行自动化的图像配准、运动校正和神经元感兴趣区域（ROI）检测。随后进行神经毡信号污染校正，并利用约束非负矩阵分解（CNMF）方法对钙信号的ΔF/F时间序列进行反卷积，以推断出相对更接近真实放电率的神经活动时间序列。
   • 空间选择性神经元的鉴定：这是分析的核心。首先将跑道长度分为50个等距的空间箱。将每个神经元的反卷积活动根据动物位置映射到对应的空间箱中，并考虑停留时间进行归一化。然后使用高斯窗平滑。
     • 关键指标计算：
       1. 空间信息量：使用Skaggs等人提出的公式计算，衡量神经元活动携带了多少关于动物位置的信息。值越高，空间编码特异性越强。
       2. 虚假分布：通过对神经元活动时间序列进行循环移位（1000次）来构建空间信息量的随机分布。
     • 鉴定标准：一个神经元被认定为具有显著的空间选择性，必须同时满足：其原始空间信息量高于虚假分布的95百分位数；其位置野内的平均活动强度是位置野外平均活动强度的2.5倍以上；并且其峰值活动在至少三分之一的任务圈次中都出现在位置野内。
   • 位置野特征提取：使用连续小波变换来识别每个神经元活动曲线中的局部最大值点，从而确定位置野的中心和宽度。此外，还计算了稀疏性指数，该指数介于0和1之间，值越小表明神经元的放电在空间上越集中，即空间调谐越精细。
   • 群体活动解码：为了评估整个神经元群体编码空间位置的整体精度，研究者采用了独立的贝叶斯解码器。他们使用奇数圈次的数据来构建“编码模型”（即每个神经元在不同位置上的平均活动模板），然后用偶数圈次的数据来测试解码效果。解码误差定义为真实位置与解码出的最可能位置之间的绝对差值。误差越小，说明群体活动对位置的表征越精确。
   • 密度分布图：为了可视化空间选择性神经元在全皮层的分布，他们将整个成像窗口离散化成小网格，计算每个网格内空间选择性神经元占总检测神经元数量的比例。
   • 统计分析：使用MATLAB进行各种统计检验，包括t检验、Wilcoxon秩和检验、双因素方差分析（ANOVA）和Kolmogorov-Smirnov检验等，以比较对照组和损伤组在各个指标上的差异。

主要研究结果 研究结果清晰地揭示了新皮层空间编码的广泛性及其对海马体的依赖性。

1. 空间选择性神经元广泛分布于新皮层且依赖于完整的海马体：

   • 在对照组小鼠的所有五个被调查的新皮层区域（RSC， M2， M1， PPC， S1）中，都发现了相当大比例的神经元表现出显著的空间选择性。平均而言，约40-80%的被检测神经元符合空间选择性标准，其中前部区域（如M2， M1）的比例往往更高。
   • 密度分布图显示，这些空间调制神经元均匀地散布在整个背侧皮层，共同形成了一条连续的环境表征带。
   • 关键发现：海马体双侧损伤极大地减少了所有皮层区域中表现出空间选择性的神经元比例。平均来看，损伤组空间选择性神经元的比例仅为对照组的约43%（对照组平均60.6%，损伤组平均26.6%）。统计比较显示，每个单独区域（RSC， M2， M1， PPC， S1）中，损伤组的比例都显著低于对照组。这表明海马体的完整性对于新皮层神经元发展出明确的空间调谐特性是必不可少的。

2. 海马损伤后残存的空间神经元编码质量下降：

   • 对于那些在损伤后仍通过筛选标准的“残存”空间神经元，研究者进一步分析了它们的编码特性。
   • 位置野宽度：两组神经元的位置野平均宽度没有显著差异。这表明海马损伤并未简单地导致位置野变宽或变窄。
   • 空间信息量与稀疏性：损伤组神经元的空间信息量显著低于对照组，而稀疏性指数显著高于对照组。这意味着，即使某些神经元仍保留了一定的位置相关性，但其放电活动在空间上的集中度和特异性（即编码的“锐利”程度）都下降了。它们的活动模式变得更加弥散，携带的精确位置信息更少。这一结果在逐个区域分析时也得到了验证。

3. 海马损伤损害了新皮层对空间的均匀表征能力：

   • 当观察所有神经元（不论是否通过筛选）的位置活动图谱时，对照组神经元的放电模式在空间上更紧凑、更稀疏。而损伤组神经元的峰值活动显著降低。
   • 专门分析空间选择性神经元时，对照组神经元在整个跑道上的峰值放电位置分布相对均匀。而损伤组神经元的峰值活动更多集中在触觉线索和奖励点附近，对跑道中间区域的表征较弱，表明其空间表征的连续性被破坏。
   • 相关性图谱分析显示，对照组神经元的群体活动模式在相邻位置高度相关，随距离增加相关性迅速下降。损伤组虽然也在对角线附近有高相关，但相关性随距离下降的模式在非线索位置显得不那么陡峭，暗示其空间表征的局部特异性减弱。

4. 海马损伤显著降低从新皮层群体活动中解码位置的精度：

   • 使用贝叶斯解码器评估位置解码误差。结果显示，损伤组在所有跑道位置上的解码误差都显著高于对照组。
   • 解码误差的整体分布显示，对照组的中位误差为7.03厘米，而损伤组高达20.35厘米，几乎是三倍。
   • 分区域解码显示，在所有五个新皮层区域中，损伤组的平均解码误差都比对照组至少高出40%。
   • 解码位置与真实位置的二维密度图直观地展示了这一差异：对照组呈现出一条清晰的对角线（解码准确），而损伤组的点则更分散在对角线周围（解码不准确）。这直接证明，海马体损伤后，新皮层神经元群体编码空间位置的集体精度严重受损。

结论与意义 本研究得出了一个明确而有力的结论：分布广泛的新皮层神经元群体能够共同形成一个连续的环境空间表征，而海马体的输出对于组织这一现象是必需的。 虽然海马损伤没有完全消除新皮层的空间选择性活动，但它严重破坏了这种表征的精度、稀疏性和完整性。海马体似乎是大脑中的一个“整合中心”或“索引器”，它将来自多个皮层区域的信息绑定起来，构建并维持一个统一而精确的空间认知地图。

这项研究的科学价值在于： 1. 深化了对“认知地图”神经基础的理解：它将空间编码的框架从传统的海马-内嗅皮层系统扩展到了整个新皮层，强调了分布式编码与核心整合枢纽（海马体）相结合的重要性。 2. 实证了海马-皮层相互作用的特定功能：为“海马体在协调和巩固皮层表征中起关键作用”的假说提供了直接的实验证据。这支持了如“索引理论”等记忆理论，该理论认为海马体为特定的体验（包括空间体验）提供了一个快速形成的索引，使得分布存储在新皮层的各种信息（感觉、运动等）能够被有效地绑定和提取。没有海马体，皮层就难以形成独特、精确的体验表征。 3. 提供了方法学范例：展示了如何结合大面积颅窗成像、系统性区域扫描和定量化分析（空间信息量、解码等）来研究全脑尺度的神经编码问题。

研究亮点 1. 重要发现：首次在同一动物身上系统性地比较了多个新皮层区域（初级、次级和联合皮层）的空间编码特性，并直接证明了这些特性普遍依赖于海马体的完整性。 2. 新颖的工作流程：采用5毫米大颅窗结合标准化网格扫描策略，实现了对背侧新皮层的广泛、系统性调查，而非局限于单个脑区。 3. 综合性分析方法：不仅进行了单神经元水平的经典分析（空间信息量、位置野），还运用了群体解码技术来评估整体表征精度，从不同层面论证了海马体损伤的影响。 4. 清晰的因果论证：通过建立海马体损伤模型，并与对照组严格对比，确立了海马体与新皮层空间编码之间的因果关系，而不仅仅是相关关系。

其他有价值的内容 研究者在讨论中也提出了一些有待未来探索的问题，例如：不同新皮层区域的空间表征在更复杂的行为任务（如多感官整合、路径规划）中是否会表现出区域特异性？动物经验如何影响新皮层空间表征的动态形成过程？其时间进程与海马位置细胞有何异同？这些方向为进一步研究海马-皮层环路在空间记忆和学习中的详细机制指明了道路。