摘要

这是一项由 Denali Therapeutics 和 Ionis Pharmaceuticals 的研究人员合作开展的原创研究，于2023年4月28日以预印本形式发布在 bioRxiv 上。该研究的主要作者包括 Scarlett J Barker、Mai B Thayer、Chaeyoung Kim、David Tatarakis 和 Sarah L Devos 等，通讯作者为 Sarah L Devos。研究团队开发了一种名为“寡核苷酸运输载体”（oligonucleotide transport vehicle, OTV）的新型平台，通过靶向人转铁蛋白受体1（human transferrin receptor 1, hTfR1）实现反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide, ASO）跨血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）的系统性递送，并在小鼠和非人灵长类动物中验证了其广泛的靶基因敲降效果。

一、研究背景与目的

ASO 是一类能够通过 RNA 酶 H1 依赖机制特异性降解靶标 RNA 的核酸类药物，在神经退行性疾病的治疗中显示出巨大潜力。然而，ASO 本身由于分子量大、带负电荷、血浆清除快等生物物理特性，无法有效跨越血脑屏障进入中枢神经系统，临床上必须通过鞘内注射或脑室内注射直接给药至脑脊液。这种直接给药方式不仅存在扩散介导的生物分布梯度，导致深部脑区药物浓度不足，还伴随注射相关不良事件的风险。因此，开发能够系统性递送 ASO 至中枢神经系统的非侵入性平台是亟待解决的关键科学问题。

转铁蛋白受体1在血脑屏障的脑内皮细胞上高表达，可通过受体介导的转胞吞作用将结合分子从血液转运至脑实质。研究团队此前已开发了“运输载体”（transport vehicle, TV）平台，通过在 Fc 结构域中工程化低亲和力 hTfR1 结合位点，成功将抗体、酶等蛋白类药物高效递送至脑内。然而，ASO 的作用位点位于细胞核内，其能否通过 TV 介导的转胞吞实现胞内有效递送和靶基因敲降尚不清楚。本研究的目的即为将 ASO 定点偶联至 TV 平台生成 OTV，并系统评估其在体外和体内的摄取、分布、靶基因敲降效率及与现有递送策略的比较优势。

二、研究流程与实验方法

研究分为以下几个主要步骤：

1. OTV 的构建与体外验证。 研究团队采用 knob-in-hole 技术，在 Fc hole 链的丝氨酸239位点引入工程化半胱氨酸，通过马来酰亚胺-C6 连接子将靶向小鼠 Malat1 长链非编码 RNA 的 ASO 定点偶联，获得寡核苷酸与 TV 摩尔比为1的 OTV。通过质谱和分子排阻色谱确认偶联纯度，并利用表面等离子体共振和细胞结合实验证实 ASO 偶联不影响 OTV 对 hTfR1 的结合亲和力与特异性。体外摄取实验在 SH-SY5Y 细胞和表达 hTfR1 的 tfrmu/hu KI 小鼠原代神经元中进行，使用 Cy3 标记的 ASO 和 Alexa-647 标记的 huIgG 进行双荧光追踪，结合超分辨显微镜观察 OTV 经内溶酶体途径的胞内转运。基因敲降效果通过 qPCR 检测 Malat1 RNA 水平评估。

2. 小鼠体内生物分布与药效学研究。 在 tfrmu/hu KI 小鼠模型中，通过单次或四次静脉注射 OTV、裸 ASO 或偶联至非 hTfR1 结合抗体的 ASO，比较各组的血浆药代动力学、脑和脊髓及外周组织的 ASO 沉积量和 Malat1 RNA 敲降程度。组织 ASO 浓度通过基于三链形成寡核苷酸的 ELISA 方法定量。利用单核 RNA 测序（single-nucleus RNA-seq, snRNA-seq）对小鼠半脑组织进行细胞类型解析，采用 Seurat 等工具进行数据预处理、降维聚类和细胞类型注释，并通过 DESeq2 进行假多细胞差异表达分析，评估各主要脑细胞类型的 Malat1 敲降情况。皮层神经元分层分析通过迭代亚聚类和假时间轨迹构建完成。

3. 与高亲和力双价 TfR 抗体偶联物的比较。 构建了基于高亲和力（0.12 nM）双价 hTfR1 抗体的 TfR:ASO 偶联物，在 tfrmu/hu KI 小鼠中与 OTV 进行头对头比较。通过动态光散射检测 OTV 或 TfR:ASO 与全长 hTfR1 蛋白孵育后的复合物聚集状态，通过 Western blot 定量各组织 hTfR1 蛋白水平，通过脑毛细血管剥离实验分离血管组分和实质组分并分别测定 huIgG 浓度以评估跨血脑屏障效率。免疫荧光染色用于观察 huIgG 在脑实质和血管的分布及其与神经元标记物 NeuN 的共定位。

4. 与脑脊液直接给药的比较。 在小鼠中比较静脉 OTV 给药与侧脑室内注射裸 ASO 后的脑、脊髓、肝脏等组织的 ASO 半衰期、Malat1 敲降持续时间以及剂量-效应关系。使用抗 ASO 抗体进行免疫组化染色，定量 ASO 在小鼠脑内的分布和与神经元的共定位比例。

5. 非人灵长类动物实验。 在食蟹猴中比较三种给药方式：鞘内注射 4 mg 裸 ASOmf、静脉注射摩尔当量的裸 ASOmf、以及静脉注射 1.1 mg/kg ASO 摩尔当量的 OTV。通过抗 ASO 抗体免疫组化染色和23个脑区与脊髓区域的 ASO 浓度定量评估生物分布均匀性，通过 qPCR 检测各区域 Malat1 RNA 敲降水平，并对丘脑组织进行 snRNA-seq 以评估各细胞类型的敲降效果。

三、主要研究结果

1. OTV 在体外实现 hTfR1 介导的 ASO 摄取和有效敲降。 双荧光追踪显示 OTV 被细胞摄取后与裸 ASO 一样，主要经内吞体-溶酶体途径转运，24小时后主要定位于溶酶体。超分辨显微镜证实 OTV 来源的 ASO 和 huIgG 共同出现在 Rab7+ 晚期内吞体和 LAMP1+ 溶酶体中。在表达 hTfR1 的原代神经元中，OTV 在所有测试浓度下均显著降低 Malat1 RNA 水平，而在野生型神经元中仅在极高浓度下引起轻微敲降，证明敲降效应依赖于 hTfR1 介导的摄取。

2. OTV 在小鼠体内实现跨血脑屏障的 ASO 沉积和广泛敲降。 单次静脉注射 OTV 后，脑内 ASO 浓度达到 9 nM，四次给药后累积至 26 nM，显著高于裸 ASO 和 Mab:ASO 对照组。四次给药后，脑和脊髓中 Malat1 RNA 水平降低约50-70%，且在纹状体、皮层、海马等多个脑区均有显著敲降。值得注意的是，OTV 还实现了对骨骼肌和心肌中 Malat1 的显著敲降。snRNA-seq 结果显示，OTV 处理组在星形胶质细胞、少突胶质细胞、神经元、小胶质细胞、血管平滑肌细胞、血管内皮细胞、周细胞和血管周围巨噬细胞等几乎所有主要脑细胞类型中均实现显著 Malat1 敲降，而裸 ASO 仅能在周细胞和血管内皮细胞中实现有限敲降。皮层神经元假时间分析表明 OTV 诱导的敲降在各皮层深度均匀分布。

3. OTV 优于高亲和力双价 TfR:ASO 偶联物。 尽管 TfR:ASO 对 hTfR1 的亲和力比 OTV 高约1000倍，但 OTV 在脑和心脏中的 ASO 沉积量显著更高。动态光散射显示 TfR:ASO 与全长 hTfR1 蛋白孵育后形成明显聚集，而 OTV 则保持单一窄峰。免疫荧光显示 OTV 给药后 huIgG 广泛均匀分布于脑实质，而 TfR:ASO 的 huIgG 主要局限于血管内，与 NeuN+ 神经元几乎没有共定位。脑毛细血管剥离实验证实 OTV 组的实质中 huIgG 浓度显著高于 TfR:ASO 组，而血管中两者相当。Western blot 显示 TfR:ASO 导致肝脏、心脏和脑血管中 hTfR1 蛋白水平显著降低，而 OTV 无此效应。这些结果表明高亲和力双价结合导致 hTfR1 二聚化和降解，阻碍了跨血脑屏障的转胞吞过程。相应地，OTV 在脑和脊髓中的 Malat1 敲降显著优于 TfR:ASO，且在神经元中的敲降为 OTV 所独有。

4. OTV 保留裸 ASO 的胞内稳定性和敲降效率。 小鼠实验中，无论通过 OTV 静脉给药还是脑室内直接给药，脑组织的 ASO 半衰期相似，表明 TV 偶联不会影响 ASO 在细胞内的稳定性。脑内 ASO 浓度-Malat1 敲降的剂量反应曲线显示 OTV 与裸 ASO 的敲降效率相当。免疫组化显示 OTV 递送的 ASO 在丘脑等深部脑区的沉积明显高于脑室内给药，且 OTV 递送的 ASO 与神经元的共定位比例显著更高。

5. OTV 在非人灵长类动物中实现均匀分布和广泛敲降。 在食蟹猴中，鞘内注射裸 ASOmf 导致从腰髓到大脑的明显浓度梯度，深部脑区如纹状体和丘脑几乎检测不到 ASOmf。相比之下，OTV 静脉给药后 ASOmf 在脑和脊髓的23个区域中分布均匀。Malat1 敲降在鞘内注射组中局限于脊髓，脑内几乎无敲降；而 OTV 组在各脑区均实现约50%的敲降。snRNA-seq 证实 OTV 在丘脑的所有主要细胞类型中均实现一致敲降，而鞘内注射组仅在少突胶质细胞和小胶质细胞中观察到轻微敲降。

四、结论与价值

本研究首次系统证明了 OTV 平台能够通过 hTfR1 介导的转胞吞作用实现 ASO 跨血脑屏障的系统性递送，并在小鼠和食蟹猴中实现广泛、累积且持续的中枢神经系统靶基因敲降。OTV 相比裸 ASO 鞘内注射和高亲和力双价 TfR:ASO 偶联物均表现出显著优势：前者受限于扩散梯度无法有效到达深部脑区，后者则因受体二聚化导致 TfR 降解和血管截留而难以进入脑实质。OTV 的均匀生物分布和跨细胞类型敲降能力为神经退行性疾病、神经肌肉疾病和周围神经病变的治疗提供了更优的递送策略。此外，OTV 平台具有高度模块化特性，可针对不同靶标 RNA 快速生成治疗分子，具有广泛的临床应用前景。

五、研究亮点

本研究的突出亮点包括：第一，创新性地将 TV 平台与 ASO 偶联，首次在体内证明 TfR 介导的转胞吞能够递送 ASO 至脑内并实现有效的 RNA 敲降；第二，通过 snRNA-seq 在单细胞分辨率上系统证明了 OTV 跨所有主要脑细胞类型的敲降能力，尤其是对神经元的敲降，这是其他 ASO 递送策略难以实现的；第三，通过直接对比高亲和力双价 TfR:ASO 偶联物，阐明了受体亲和力与价态对跨血脑屏障效率的复杂影响，为 TV 平台的设计原则提供了重要证据；第四，在非人灵长类动物中验证了 OTV 的临床转化潜力，展示了其相对于当前鞘内注射标准疗法的分布均匀性优势。

此外，研究还观察到 OTV 在骨骼肌、心肌、膈肌和视网膜等外周组织中实现了显著增强的 ASO 沉积和敲降，提示该平台可能扩展至非肝性外周组织疾病的应用。研究团队还指出，OTV 给药后 ASO 在肝、肾等清除器官中的沉积与毒性问题仍需在后续治疗性寡核苷酸研究中进一步评估。