一、 主要作者与发表信息
本研究由维也纳技术大学化学、环境与生物科学工程研究所整合生物过程开发小组的研究人员Oliver Spadiut和Thomas Gundinger，以及Zeta GmbH研发负责人Birgit Pittermann和通讯作者Christoph Slouka共同完成。研究成果以题为“Spatially Resolved Effects of Protein Freeze-Thawing in a Small-Scale Model Using Monoclonal Antibodies”的论文形式，发表于2020年4月21日的学术期刊*Pharmaceutics*（第12卷，第4期，文章编号382）。
二、 学术背景与研究目的
本研究的科学领域属于生物制药工程，具体聚焦于下游加工和药物制剂中的蛋白质稳定化技术。冻融操作是单克隆抗体等生物制药产品在上下游单元操作之间储存和稳定化的常用手段。然而，该过程常伴随产品损伤，导致活性损失。已知有多种效应可导致损伤，包括冷变性、由蛋白质浓度不均匀性引起的聚集效应，以及在冷冻循环中因pH和缓冲液成分变化（尤其是磷酸盐缓冲液结晶导致的pH骤降）所引发的问题。尽管这些效应已被认识，但在实际冻融过程中，蛋白质、缓冲盐等成分在冻结样品块内部的空间分布异质性及其对产品质量的具体影响，尤其是在不同冷冻速率下的变化规律，缺乏详细的空间分辨研究。
因此，本研究旨在通过一个商业化的小规模蛋白质冷冻系统，深入探究不同冷冻速率对磷酸盐缓冲体系中免疫球蛋白G（IgG）冻融过程的影响。具体目标包括：1）以空间分辨的方式分析冻融后样品在蛋白质浓度、pH、电导率和聚集度等方面的差异；2）评估冷冻速率（通过冰形成速率IFR量化）对上述异质性的影响；3）探索使用简便的分析方法（如电导率和总蛋白浓度测定）来监测复杂异质性的可行性，以减少在筛选实验中依赖昂贵耗时的HPLC分析；4）将小规模模型的研究趋势与中试规模系统进行对比验证，以评估小规模模型用于工艺筛选和放大的潜力。
三、 详细研究流程与方法
本研究流程清晰，主要包括单克隆抗体的生产与纯化、不同速率下的冻融实验、空间分辨采样以及多维度分析测试，最后进行数据建模与跨尺度对比。
第一步骤：单克隆抗体的生产、纯化与制剂。 研究使用中国仓鼠卵巢细胞生产IgG，收获不同批次的细胞上清液混合后于4°C储存。纯化采用Protein A亲和层析法，使用自装的Kaneka KanCapA填料柱，在ÄKTA pure系统上进行。上清液经过滤和稀释后上样，依次使用结合缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液进行处理，洗脱的IgG立即用结合缓冲液中和以防止聚集。纯化后的抗体通过切向流过滤系统浓缩至25-30 g/L，并用制剂缓冲液进行10倍体积的透析过滤。制剂缓冲液成分为20 mM NaH₂PO₄, pH 6.0, 9 g/L NaCl, 0.2 g/L 聚山梨酯80。最后将IgG稀释至最终浓度20 g/L，并经0.22 μm过滤后用于冷冻实验。
第二步骤：冻融实验设计与执行。 核心实验设备为Zeta GmbH的LabFreeze小规模实验室冻融系统，工作体积200 mL。冷却由Huber Unistat 705恒温器提供，冷却介质为硅油。系统配备8个温度探头（6个位于冷冻室内，2个位于进出口），用于全程记录温度。研究测试了四种不同的冷冻程序：三个采用线性降温速率（0.125°C/min， 0.25°C/min），另一个为“无设定速率”的最快速冷冻（约2.5°C/min）。所有实验均从-2°C开始线性降温至-32°C结束。通过温度数据计算了关键参数“冰形成速率（Ice Formation Rate, IFR）”，其定义为样品质量除以相变时间与热交换面积的乘积（kg/(min·m²)），用于量化冷冻强度并作为不同规模系统间比较的标度参数。
第三步骤：空间分辨采样。 为了在融化前捕获冻块内部的异质性，研究采用了独创的空间分辨采样方法。在4°C的冷室内，使用固定钻床对完全冻结的样品块进行钻孔取样。采样点根据冷冻室内的温度探头位置进行设计（对应于文中图2的红圈位置），共钻取6个圆柱形样品，每个样品贯穿冻块的垂直剖面，体积约为0.98 mL。这些样品被转移至离心管，解冻后进行后续分析。这种方法确保了能够检测到冻块内部不同位置（如首先冻结区域、最后冻结区域、中心区域）的组成差异。
第四步骤：多维度分析测试。 对每个空间采样点的解冻样品进行了一系列分析： 1. 总蛋白浓度：由于制剂中仅含IgG，采用Bradford法在595 nm波长下测定，作为IgG分布的直接指标。 2. IgG滴度：采用Protein A亲和HPLC进行准确定量，使用Poros A色谱柱，UV 280 nm检测，以校准曲线计算浓度。 3. IgG聚集体测定：采用尺寸排阻HPLC分析可溶性聚集体含量。使用MAbPac SEC-1色谱柱，比较聚集体峰与总峰面积（单体+聚集体）的比值来计算百分比。 4. pH测量：使用微型pH电极直接测量。 5. 电导率测量：采用一种精密的阻抗谱法而非常规电导率仪。将样品置于电容式测量池中，在特定频率和振幅范围内测量阻抗，通过拟合谱图提取溶液电阻，再根据电极几何尺寸换算成电导率。此法可获得高精度数据，用于反映离子（NaCl, Na₃PO₄）浓度的空间分布。
第五步骤：数据分析与模型验证。 首先，使用线性回归模型分析不同位置样品电导率变化与IgG滴度变化之间的相关性，以评估简便指标（电导率）替代复杂分析（HPLC）的潜力。其次，运用主成分分析法对滴度、电导率和聚集体数据进行分析，以区分不同冷冻速率和采样位置对整体数据集的影响模式。最后，将小规模系统获得的最佳冷冻速率趋势（基于IFR），在一个工作体积为700 mL的PilotFreeze中试系统上进行验证。中试系统同样进行空间采样（水平与垂直方向共6点），并测定电导率和Bradford总蛋白浓度，以比较其异质性变化趋势与小规模模型是否一致。
四、 主要研究结果
1. 冷冻特性与温度分布异质性： 温度记录显示，尽管恒温器设定点控制良好，但冷冻室内部存在显著的温差（超过10°C）。冷冻首先发生在冷却液进出口的垂直方向区域，然后向中心扩展，最后冻结的区域是样品块的两侧区域。这种不均匀的冻结进程直接导致了溶质（蛋白质和盐）的重新分布。计算出的IFR值表明，由于设备隔热问题，实际达到的IFR低于理论目标值，但最快的冷冻程序（#4）获得了最高的IFR（0.220 kg/(min·m²)）。
2. 缓冲液成分的空间异质性： pH测量结果显示，所有样品解冻后的pH值均与初始缓冲液基本一致，变化不超过2.7%，表明制剂缓冲液的缓冲能力足以抵消冻结过程中可能发生的局部pH剧烈波动。然而，电导率数据揭示了惊人的盐浓度空间异质性。在慢速冷冻（0.125°C/min， IFR最低）下，样品块两侧区域（对应最后冻结区）的电导率增幅最高可达93.7%，意味着盐浓度几乎翻倍；而靠近冷却液入口的区域则出现盐分贫乏（电导率降低达18.9%）。相反，在最快速冷冻（IFR最高）下，所有采样点的电导率变化幅度显著减小，最大增幅仅为46.8%，表明快速的冷冻有效地抑制了盐分的宏观分离。
3. 产品质量的空间异质性： IgG滴度的空间分布模式与电导率高度相似。在慢速冷冻下，最后冻结的两侧区域蛋白质浓度富集高达68.1%，而在快速冷冻下，最大富集度降至27.2%。这证实了蛋白质与盐分在冰晶生长过程中被共同排挤到未冻结的浓缩液相中，并在最后冻结的区域高度聚集。SEC-HPLC分析显示，冻融过程增加了可溶性聚集体的含量。基础物料中的聚集体约为2%，经过冻融后，在慢速和中等速率下，某些区域的聚集体含量最高增加了50.3%（绝对值达到约2.6%）。虽然绝对聚集水平在本研究条件下相对较低（%），但数据表明，在蛋白质和盐浓度极高的局部“热点”区域，聚集趋势确实增强。值得强调的是，快速冷冻下的聚集体增幅相对较低。
4. 关键参数间的相关性分析与方法简化验证： 主成分分析成功地将样品按其在冻块中的位置（首先冻结区、中心区、最后冻结区）和按冷冻速率（特别是最快的#4批次）区分开来。更重要的是，线性回归分析表明，电导率的变化百分比与IgG滴度的变化百分比在冻块的关键区域（中心区和两侧区）呈强相关性（R² 值在0.8-1之间）。这意味着，通过简单的电导率空间分布测量，可以可靠地预测蛋白质浓度的空间异质性，从而在工艺筛选中大幅减少对HPLC的依赖。同样，Bradford法测定的总蛋白浓度与HPLC滴度结果也高度一致，进一步支持了使用简便光度法进行快速评估的可行性。
5. 跨尺度验证与IFR的应用价值： 在中试规模系统的验证实验中，观察到了与小规模模型一致的趋势：更高的IFR（更快的冷冻）导致电导率和总蛋白浓度的最大变化幅度降低。尽管两个系统的几何形状和热传递方式不同，导致IFR绝对值存在差异，但变化趋势的相似性表明，IFR可以作为一个有用的关键参数来关联不同规模的冷冻过程。研究计算了一个经验性的相关因子（1.58），用于将小规模系统的IFR结果转化到该特定中试系统。然而，一个值得注意的发现是，在中试系统的最快冷冻测试中，解冻后总蛋白回收率下降了28%，作者推测可能是形成了SEC无法检测到的不溶性超大聚集体，这提示在放大过程中需对配方（如表面活性剂浓度）进行进一步优化。
五、 研究结论与价值
本研究系统性地揭示了单克隆抗体在磷酸盐缓冲体系冻融过程中存在的显著空间异质性。主要结论是：缓慢的冷冻速率会导致缓冲盐和蛋白质在冻结样品内部分布严重不均，形成局部的高浓度“热点”，这些区域可能加剧蛋白质不稳定性风险；而快速的冷冻速率（表现为较高的IFR）能有效减少这种宏观异质性，从而获得更均一的最终产品，并抑制聚集体的增加。
研究的科学价值在于：1）提供了关于冻融诱导异质性的详细空间分辨实验证据，深化了对该物理化学过程的理解；2）引入了“冰形成速率”作为量化冷冻强度和进行跨尺度比较的有效参数；3）验证了电导率和Bradford总蛋白测定这两种简便、低成本的分析方法，能够可靠地监测冻融过程中的关键异质性，为高通量工艺开发筛选提供了实用工具。
应用价值显著：本研究证实，商业化的小规模冻融系统可以作为有效的工艺开发模型平台，能够以更少的物料消耗和更低的成本，快速筛选出有利于产品稳定性的冷冻条件（如高冷冻速率），并将趋势性结论向生产规模放大提供指导。这对于降低生物制药开发成本、加速工艺优化具有重要意义。
六、 研究亮点
七、 其他有价值内容
研究还指出了一些有价值的细节和未来方向：例如，尽管pH在解冻后恢复，但在冻结状态的低温下，磷酸盐缓冲液的pH会发生剧烈变化（可降至3.0），这个过程本身可能对蛋白质造成损伤；表面活性剂聚山梨酯80的添加有助于稳定，但在某些极端条件下（如中试快速冷冻出现的蛋白损失）可能不足，提示需要综合优化配方与工艺；对于不溶性聚集体的监测，可能需要结合微流成像等其他技术。这些点为后续更深入的研究指明了方向。