本研究的主要作者为Gabriella Nilsson Hall, Luís Freitas Mendes, Charikleia Gklava, Liesbet Geris, Frank P. Luyten和Ioannis Papantoniou，他们来自比利时鲁汶大学（KU Leuven）发育与再生系骨骼生物学与工程研究中心的Prometheus骨骼组织工程部门。Liesbet Geris同时隶属于列日大学Giga In Silico Medicine研究所及鲁汶大学生物力学系。该研究成果以题为“Developmentally Engineered Callus Organoid Bioassemblies Exhibit Predictive In Vivo Long Bone Healing”的论文形式，于2019年12月10日在线发表在学术期刊《Advanced Science》（Adv. Sci. 2020, 7, 1902295）上。
本研究的学术背景集中于再生医学，特别是骨骼组织工程领域。尽管细胞疗法制造领域已取得重大进展，但大多数组织工程高级治疗医药产品（Tissue-Engineered Advanced Therapy Medicinal Products, TE-ATMPs）缺乏能够预测其在体内性能的质量属性，这阻碍了其临床转化。为了解决这些障碍，再生医学领域正在发生发育生物学原理与工程学原理的概念性和技术性融合，即“发育工程学”（Developmental Engineering）策略。该策略旨在模拟发育事件，同时确保临床环境下的稳健性和可预测结果。在长骨愈合的自然过程中，会形成一个称为“软骨痂”（soft callus）的软骨中间体，随后通过类似于发育过程中软骨内成骨（endochondral ossification）的过程转化为骨骼。骨膜来源的细胞是软骨痂形成的主要贡献者，其中含有强效的骨骼干细胞。因此，本研究旨在利用人类骨膜来源细胞（Human Periosteum-Derived Cells, hPDCs），通过模拟发育和再生的工程策略，构建能够预测性地修复大段骨缺损的组织工程产品。
研究的详细工作流程包括多个严谨的步骤。首先，研究人员从多名捐赠者的骨膜活检组织中分离出hPDCs，并创建细胞库进行扩增。核心的体外工程化流程始于微球体（microspheroid）的形成。他们使用特制的琼脂糖微孔阵列，接种hPDCs（每个微球体约250个细胞），使其在5小时内自组装形成均一大小的细胞球。随后，将这些微球体在化学成分确定的软骨形成培养基中进行长达4周的培养分化。培养基中含有多种生长因子，如BMP-2、GDF-5、TGF-β1等，以诱导软骨形成及后续的肥大化进程。在整个培养期间，研究人员系统地表征了微球体的动态变化。他们通过活/死染色评估细胞活力；使用EdU掺入实验和Ki-67基因表达分析细胞增殖；通过DNA定量监测细胞数量变化；利用鬼笔环肽（phalloidin）染色观察细胞骨架肌动蛋白（F-actin）的重排。为了评估分化状态，他们进行了实时定量PCR（qRT-PCR）检测一系列关键基因的表达，包括早期软骨转录因子SOX9、软骨基质标志物COL2A1、早期骨标志物RUNX2和OSX（SP7）、肥大化标志物COL10A1和IHH，以及骨相关标志物ALP和IBSP（BSP）。同时，通过阿尔新蓝（Alcian blue）、番红O（Safranin O）染色评估软骨特异性糖胺聚糖（GAG）的沉积，并通过免疫荧光染色检测IHH、OSX、COL2等蛋白的表达。基于这些体外表征结果，研究团队将培养不同时间的微球体分别定义为：第0天的细胞聚集体（微球体）、第14天的微组织（microtissue）以及第21天的“骨痂类器官”（callus organoid）。
为了验证这些工程化模块在体内的功能自主性（autonomy），研究进行了异位（皮下）植入实验。他们将单个第21天的骨痂类器官（连同其培养微孔平台）植入免疫缺陷小鼠皮下，4周后通过纳米计算机断层扫描（nano-CT）和 histological analysis进行评价。结果显示，单个类器官形成了独立的矿化球体，内部含有骨基质、骨髓腔、破骨细胞活性迹象以及血管，证实了其作为半自主性骨形成模块的能力。
接下来，研究探索了将这些微模块作为“活体生物墨水”（living bio-ink）进行自下而上（bottom-up）组装以构建更大组织的潜力。他们将约3000个第14天或第21天的微模块从微孔中取出，聚集在定制的琼脂糖大孔中，使其在24小时内自发融合成更大的多模块结构（construct），同时以传统方法制备的、含有同等数量细胞的大 pellets 作为对照。对这些组装体进行组织学染色（阿尔新蓝、番红O等），比较了细胞外基质（ECM）的分布均匀性。随后，将这些组装体（第7、14、21天）及对照大 pellets 植入小鼠皮下4周和8周，通过nano-CT量化矿化体积，并通过组织学（番红O/快绿、Masson三色、TRAP、CD31、人源骨钙素hOCN免疫组化）详细分析新生组织的成分、血管化、骨髓形成、宿主细胞贡献以及纤维组织残留情况。
在证明了骨痂类器官组装体具有形成大型骨器官的能力后，研究进入了最关键的环节——修复小鼠临界尺寸长骨缺损（critical-sized long bone defect）。他们根据胫骨缺损的尺寸（4毫米）定制了琼脂糖模具，将约6000个第21天的骨痂类器官组装其中，融合24小时后形成适配缺损形状的 scaffold-free 植入物。将其植入小鼠胫骨缺损处，并用外固定架固定。通过系列体内 micro-CT 扫描（第1、2、4、6、8周）监测缺损桥接和矿化过程。8周后，取出胫骨进行 ex vivo nano-CT 扫描，量化矿化百分比、髓腔占比、骨小梁厚度等参数，并与同年龄、同性别小鼠的天然胫骨进行结构对比。最后，对愈合的缺损进行系统的组织学分析（H&E、Masson三色、hOCN染色），评估骨愈合质量、骨髓腔成熟度及植入细胞贡献。
为了深入理解骨痂类器官获得功能自主性的分子机制，研究团队对第0、7、14、21天的微球体以及传统大 pellet 进行了RNA测序（RNA-seq）分析。他们分析了差异表达基因，利用聚类分析和基因本体论（Gene Ontology, GO）富集分析探究了随时间变化的生物学过程，并特别关注了调控软骨内成骨的关键信号通路（如Wnt、BMP、FGF、IHH/PTHrP通路）和相关基因的表达模式。
研究取得了一系列重要结果。在体外培养过程中，hPDC微球体成功重现了软骨内成骨的早期模式：初期细胞增殖活跃，随后增殖下降伴随分化；基因表达显示SOX9和COL2A1早期上调，标志着软骨形成；随后RUNX2、OSX、COL10A1和IHH表达显著升高，指示其向（前）肥大软骨细胞表型分化；组织学染色证实了软骨特异性基质沉积和IHH、OSX蛋白的表达。异位植入实验证明，单个第21天骨痂类器官能够自主形成包含骨髓和血管的“骨微器官”。组装实验表明，尽管经过长期培养并分泌了大量ECM，骨痂类器官仍能在24小时内快速融合。由第21天类器官组装而成的结构，在异位植入后形成的骨器官中，骨髓腔更大、纤维组织残留极少，且血管化更丰富，显著优于第14天组装体和传统大 pellet 对照。RNA-seq分析揭示了其分子轨迹与生长板发育高度相似：早期（第7天）上调与软骨细胞增殖和分化相关的基因（如IGF1, SOX5/6/9, PTHrP），后期（第14-21天）则转变为与肥大化、ECM重塑、血管生成和矿化相关的基因特征（如IHH, OSX, IBSP, CNMD, Wnt4）。这些基因特征为类器官的“功能自主性”提供了分子标签。最令人瞩目的结果是，由第21天骨痂类器官组装而成的植入物，成功修复了小鼠的临界尺寸胫骨缺损。影像学和组织学显示，缺损在4周内实现桥接，8周时形成了具有皮质骨和中央骨髓腔的成熟骨结构，其形态学参数（如矿化百分比、髓腔占比）与天然胫骨无显著差异，且无纤维组织干扰，植入的人源细胞持续参与了骨形成。
本研究的结论是，成功开发了一种基于发育工程学原理的模块化、自下而上的生物制造策略。利用人骨膜来源细胞制造的“骨痂类器官”是具有半自主功能的活体模块，能够通过模拟内源性软骨内成骨过程，稳健地形成骨器官。这些类器官可以作为“活体生物墨水”组装成大型、无支架的工程组织，并在体内展现出可预测的、强大的长骨缺损修复能力，再生骨的形态与天然骨高度相似。这标志着朝着“按设计制造骨骼”（bone by design）的目标迈出了关键一步。
该研究的亮点在于：第一，重要的科学发现：首次报道了能够模拟软骨痂发育、并具备体内骨器官形成自主性的工程化“骨痂类器官”；揭示了其功能自主性背后的特异性基因表达特征。第二，研究方法和流程的创新：将发育生物学理念与模块化组织工程相结合，创建了从细胞微球体到功能类器官，再到可植入大结构的标准化、可扩展工作流程；成功将类器官作为基础单元用于修复大段骨缺损。第三，研究对象的特殊性：选用具有优异骨骼再生潜力的骨膜来源细胞作为起始材料，更贴近生理性骨折愈合的细胞来源。
此外，研究还展望了未来的技术挑战和应用潜力，包括：将静态培养过程转化为生物反应器系统以实现大规模自动化生产；与生物材料结合以制造厘米级植入物并可能增强性能；整合血管化策略（如与内皮细胞共培养或采用SWIFT生物打印技术）以促进大型植入物的存活和整合；利用新兴的单细胞操控和生物打印技术进行复杂几何形状的构建；以及将近期发现的纯化骨骼干细胞群应用于此策略以进一步提高效率。这些内容为进一步推动该技术走向临床转化提供了清晰的路线图。