关于SAM域蛋白9样蛋白（SAM domain‑containing protein 9‑like, SAMD9L）独立于先天性免疫激活功能抑制黄病毒翻译的研究报告

本研究是一项原创性实验研究，由法国、爱沙尼亚和加拿大的多个研究团队合作完成。主要作者包括Marion Cannac, Jim Zoladek, Inès Bribes, Mathis Fresneau-Resende, Alexandre Legrand, Rémi Demeure, Eva Žusinaite, Andres Merits, Lucie Etienne和通讯作者Sébastien Nisolé。作者单位涵盖蒙彼利尔大学（Institut de Recherche en Infectiologie de Montpellier, IRIM）、里昂大学（Centre International de Recherche en Infectiologie, CIRI）、塔尔图大学（University of Tartu）以及加拿大国家科学研究院（Institut National de la Recherche Scientifique）等机构。该研究于2025年12月8日发表在开放获取期刊《PLOS Pathogens》上。

一、 学术背景与研究目的

本研究属于病毒学与宿主先天性免疫交叉领域，重点关注干扰素刺激基因（Interferon-stimulated genes, ISGs）的抗病毒机制。干扰素反应是宿主抵御病毒感染的第一道防线，通过诱导数百个ISGs的表达来抑制病毒复制的各个阶段。其中，病毒蛋白翻译这一完全依赖宿主细胞机器的步骤，是多个ISGs的关键靶点。

SAM域蛋白9（SAMD9）及其旁系同源物SAM域蛋白9样蛋白（SAMD9L）是近年来备受关注的ISGs。它们具有相似的蛋白结构，都包含一个类Schlafen（schlafen-like）核糖核酸酶结构域。研究表明，SAMD9和SAMD9L能通过抑制翻译来限制多种病毒的复制，如痘病毒、轮状病毒和呼肠孤病毒。值得注意的是，只有SAMD9L被证明能够抑制人类免疫缺陷病毒（HIV-1）等慢病毒。然而，SAMD9与SAMD9L的抗病毒谱存在差异，其具体机制和靶向病毒的广度尚未完全阐明。特别是，尽管SAMD9L在一个针对西尼罗病毒（West Nile virus, WNV）的ISG筛选筛选中被鉴定为潜在的抑制因子，但其对黄病毒科（Flaviviridae）病毒的抗病毒活性尚未经过正式和系统的研究。

黄病毒是一类通过节肢动物（如蚊子和蜱）传播的单股正链RNA病毒，包括西尼罗病毒（WNV）、寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）、登革病毒（Dengue virus, DENV）、乌苏图病毒（Usutu virus, USUV）和蜱传脑炎病毒（Tick-borne encephalitis virus, TBEV）等，对全球公共卫生构成重大威胁。因此，发现并阐明宿主细胞内新的抗黄病毒因子及其作用机制，对于理解病毒-宿主相互作用和开发新的抗病毒策略至关重要。

基于此，本研究的核心目标是：1）明确SAMD9L（而非SAMD9）是否是一种广谱的黄病毒限制因子；2）在生理相关的靶细胞（特别是髓系细胞）中验证SAMD9L在I型干扰素（IFN-I）介导的抗病毒反应中的关键作用；3）阐明SAMD9L抑制黄病毒复制的具体分子机制，特别是其是否通过靶向病毒RNA翻译来实现；4）探究SAMD9L的抗病毒活性与其新近报道的先天性免疫激活功能（即作为模式识别受体，Pattern Recognition Receptor, PRR）之间的关系，判断两者是否相互独立。

二、 详细研究流程

本研究包含一系列严谨且逻辑连贯的实验流程，主要可分为以下五个核心部分：

流程一：验证SAMD9L对黄病毒的广谱抑制活性。 首先，研究团队在一个包含570个人类ISGs的慢病毒表达文库筛选基础上，对包括SAMD9L在内的10个最有潜力的候选基因以及7个无活性的对照ISG进行了二次验证。实验在HEK293T细胞中进行，通过慢病毒转导表达各个ISG，然后分别用WNV和USUV感染，48小时后通过流式细胞术检测感染率。为了区分SAMD9L与其旁系同源物SAMD9的功能差异，研究者构建了野生型（WT）及催化结构域功能缺失型（Loss-of-function, LOF）的SAMD9和SAMD9L表达质粒（N端融合Flag-mCherry标签）。将质粒转染HEK293T细胞，验证蛋白表达后，再进行WNV和USUV感染实验。此外，为了将研究扩展到更多黄病毒，研究转向了Vero E6细胞。通过慢病毒转导表达无标签的SAMD9L或已知的抗黄病毒因子SHFL作为阳性对照，然后用DENV（血清型2）、ZIKV、WNV和USUV分别感染细胞，在48或72小时后通过流式细胞术评估感染率。

流程二：探究SAMD9L在髓系细胞IFN-I抗病毒反应中的关键作用。 鉴于髓系细胞（单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、小胶质细胞）是黄病毒感染的主要靶细胞，本研究重点评估了内源性SAMD9L在这些细胞中的作用。首先，通过实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）和蛋白质印迹法（Western blot）检测了IFN-I处理对原代人髓系细胞（单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、小胶质样细胞）以及人髓系细胞系（U937单核细胞系及其分化后的巨噬样细胞、HMC3小胶质细胞系）中SAMD9和SAMD9L表达的上调情况。 随后，在HMC3小胶质细胞和原代单核细胞来源的巨噬细胞（Monocyte-derived macrophages, MDMs）中进行了基因敲低（knockdown）功能验证实验。使用慢病毒载体递送靶向SAMD9、SAMD9L或对照基因CD241的短发夹RNA（shRNA）。转导24小时后，用IFN-I预处理细胞以诱导ISG表达，然后感染WNV。通过RT-qPCR检测细胞内病毒RNA水平，以及通过病毒滴度测定（Titer）检测上清液中的病毒颗粒产量，来评估SAMD9L敲低对IFN-I抗病毒效果的影响。

流程三：阐明SAMD9L抑制黄病毒复制的具体机制——靶向翻译步骤。 为确定SAMD9L作用于病毒生命周期的哪个阶段，研究设计了多组实验。首先，利用基于WNV的“报告病毒颗粒”（Reporter Viral Particles, RVPs）。该颗粒含有用增强型绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP）基因取代结构蛋白编码区的复制子基因组，能进行感染和RNA复制（表达EGFP），但不能产生子代病毒。将RVPs感染过表达SAMD9L的HEK293T细胞，通过流式细胞术检测EGFP表达，以判断抑制发生在组装/释放之前。 其次，为了更精确地定位到翻译步骤，研究者绕过了病毒进入过程，直接向细胞中转染表达EGFP的构建体。这些构建体包括：1）单纯的CMV启动子驱动的GFP质粒；2）HIV-1前病毒构建体（表达GFP）；3）WNV复制子构建体（表达GFP）。将上述构建体与表达mCherry（对照）、野生型/LOF型SAMD9或SAMD9L的质粒共转染HEK293T细胞。48小时后，通过流式细胞术和Western blot检测GFP蛋白表达水平，同时通过RT-qPCR验证GFP mRNA水平是否一致，以排除转录水平的影响。 最后，为了直接、定量地评估SAMD9L对黄病毒RNA翻译的抑制，研究采用了体外转录（in vitro transcription）的纳米荧光素酶（Nanoluciferase, Nanoluc）报告系统。研究者构建了多种黄病毒（DENV, ZIKV, WNV, TBEV）的复制子，其中结构基因被Nanoluc基因取代。将这些复制子RNA或对照的Nanoluc RNA直接转染到已预先表达野生型或LOF型SAMD9/SAMD9L的HEK293T细胞中。8小时后，通过测定Nanoluc酶活性来直接量化翻译效率。

流程四：探究SAMD9L抗病毒活性与免疫激活功能的独立性。 近期有研究报道SAMD9/SAMD9L家族蛋白可作为细胞质PRR，感知双链核酸并激活先天性免疫反应。为厘清SAMD9L的抗黄病毒活性是源于直接的翻译抑制，还是间接通过诱导IFN和ISGs实现，本研究进行了以下验证： 首先，在IFN信号完整的A549细胞中，分别转染N端标签（Flag-mCherry）或未标签的野生型/LOF型SAMD9/SAMD9L质粒。24小时后，通过RT-qPCR检测一系列先天性免疫相关基因（IFN-β, IFN-λ2/3, CCL5, CXCL10, MX1, IFIT2）的mRNA水平。48小时后，通过基于报告细胞的荧光素酶法检测上清液中IFN-I的分泌水平。 其次，在IFN信号通路缺陷的HEK293T细胞（已证实SAMD9L在其中能有效抑制病毒）中，重复上述检测，确认其抗病毒活性不依赖于该细胞的免疫诱导能力。 最后，使用JAK1/JAK2抑制剂鲁索替尼（Ruxolitinib）进行阻断实验。在A549细胞中过表达未标签的SAMD9L，同时用鲁索替尼处理以完全阻断IFN信号通路下游的ISG诱导。通过Western blot验证ISG（MX1, SHFL, ISG20）诱导被成功抑制后，再感染WNV，通过流式细胞术评估SAMD9L的抗病毒活性是否依然存在。

流程五：数据分析方法。 所有实验均包含至少两次生物学重复。流式细胞术数据使用FlowJo软件分析。Western blot图像使用ImageJ软件分析。RT-qPCR和病毒滴度数据使用GraphPad Prism软件进行统计分析。根据实验设计，采用适当的统计检验方法，如非配对t检验、单因素方差分析（one-way ANOVA）配合Dunnett’s或Fisher’s多重比较检验、双因素方差分析（two-way ANOVA）配合Tukey’s多重比较检验等。数据以均值±标准误表示，并标注统计学显著性。

三、 主要研究结果

结果一：SAMD9L（而非SAMD9）能广谱抑制多种黄病毒的复制。 在二次筛选中，SAMD9L被确认为抑制WNV和USUV复制最有效的ISG之一。在HEK293T细胞中，过表达野生型SAMD9L能显著抑制WNV和USUV的感染，而其LOF突变体则完全丧失此活性。相反，无论是野生型还是LOF型的SAMD9，对这两种病毒的复制均无抑制效果。在Vero E6细胞中，过表达无标签的SAMD9L对DENV-2、ZIKV、WNV和USUV的复制均产生了强烈且一致的抑制，其抑制效果甚至强于已知的抗病毒因子SHFL。对DENV其他血清型（3和4型）的测试也得到了相同结论。这些数据明确表明，SAMD9L是一种广谱的黄病毒限制因子，而SAMD9不具备此功能。

结果二：内源性SAMD9L是髓系细胞中IFN-I抗黄病毒活性的关键介质。 RT-qPCR和Western blot结果显示，IFN-I处理能显著上调原代人髓系细胞和人髓系细胞系中SAMD9和SAMD9L的表达。在HMC3小胶质细胞中，敲低SAMD9L能部分逆转IFN-I对WNV复制的抑制作用，导致细胞内病毒RNA水平和上清病毒滴度显著上升。有趣的是，即使在没有外源性IFN-I预处理的情况下，敲低SAMD9L也能增强WNV的复制，提示病毒感染本身诱导的内源性IFN足以激活SAMD9L并发挥部分抗病毒作用。与此形成鲜明对比的是，敲低SAMD9对IFN-I的抗病毒效果无任何影响。在原代巨噬细胞（MDMs）中重复该实验，得到了完全一致的结果：SAMD9L（而非SAMD9）的敲低削弱了IFN-I的保护作用，并在无预处理时加剧了病毒感染。这些结果在生理相关的靶细胞中确立了SAMD9L作为IFN-I抗黄病毒防御体系中的关键效应分子。

结果三：SAMD9L通过靶向病毒RNA翻译步骤抑制黄病毒复制，且依赖其类Schlafen核糖核酸酶结构域。 机制研究发现：1）使用WNV RVPs实验表明，SAMD9L过表达能强烈抑制EGFP报告基因的表达，证明其抑制作用发生在病毒生命周期的早期（组装/释放之前）。2）在绕过病毒进入的直接转染实验中，当GFP由WNV复制子编码时，野生型SAMD9L对其表达的抑制最为强烈；而当GFP由CMV启动子或HIV-1构建体编码时，抑制效果微弱且不显著。这提示SAMD9L的抑制作用具有选择性，可能针对病毒RNA的特定特征。所有实验中，SAMD9L的LOF突变体均无抑制活性，SAMD9（无论野生型或LOF型）也无效。3）最直接的证据来自体外转录RNA转染实验。过表达野生型SAMD9L能显著抑制所有测试的黄病毒（DENV, ZIKV, WNV, TBEV）复制子RNA的翻译（Nanoluc活性下降），而其LOF突变体则不能。这确凿地证明了SAMD9L通过靶向翻译步骤来限制黄病毒，且该功能严格依赖于其类Schlafen核糖核酸酶结构域的催化活性。一个有趣的发现是，野生型SAMD9在直接RNA转染实验中也能抑制黄病毒复制子的翻译，尽管它在完整的病毒感染过程中无效。这暗示SAMD9本身具备抑制黄病毒RNA翻译的潜力，但其在感染环境中的激活可能是病毒特异性的，或者黄病毒已进化出逃避或对抗SAMD9的机制。

结果四：SAMD9L的抗黄病毒活性独立于其先天性免疫激活功能。 免疫激活实验发现，蛋白质标签的位置显著影响SAMD9/SAMD9L诱导免疫反应的能力。N端标签的SAMD9/SAMD9L（本研究中用于大部分抗病毒实验的版本）过表达时，在A549细胞中未能诱导IFN/ISG/趋化因子的表达或IFN-I的分泌。然而，未标签的野生型SAMD9和SAMD9L则能有效触发先天性免疫反应，诱导MX1、IFIT2等ISG的表达和IFN-I的分泌，且此功能也部分依赖于完整的催化结构域。尽管如此，关键证据表明抗病毒与免疫激活是分离的：首先，N端标签的SAMD9L虽不能激活免疫，却能强效抑制黄病毒复制和翻译。其次，在IFN信号缺陷的HEK293T细胞中，未标签的SAMD9L同样能抑制WNV复制。最后，也是最具说服力的，在使用鲁索替尼完全阻断IFN信号通路后，未标签的SAMD9L在A549细胞中抑制WNV复制的能力依然完好无损。这些数据共同证明，SAMD9L通过直接抑制病毒RNA翻译来发挥抗黄病毒作用，这一机制不依赖于其诱导先天性免疫反应的能力。

四、 研究结论与价值

本研究得出以下核心结论：1）人SAM域蛋白9样蛋白（SAMD9L）是一个新型的、广谱的黄病毒限制因子，能有效抑制西尼罗病毒、寨卡病毒、登革病毒和乌苏图病毒的复制，而其旁系同源物SAMD9不具备此活性。2）在黄病毒感染的重要靶细胞——髓系细胞（特别是小胶质细胞和巨噬细胞）中，内源性SAMD9L是I型干扰素发挥抗病毒作用的关键效应分子。3）SAMD9L通过靶向黄病毒生命周期的翻译步骤来抑制病毒复制，该功能严格依赖于其蛋白内部的类Schlafen核糖核酸酶结构域。4）尽管SAMD9L过表达可以激活先天性免疫反应，但其抗黄病毒活性是独立于该免疫激活功能的，主要依靠其直接的翻译抑制能力。

本研究的科学价值重大：它显著拓展了已知的SAMD9L抗病毒谱，将其确立为对抗具有重要公共卫生意义的黄病毒家族的关键宿主因子。研究揭示了SAMD9与SAMD9L这两个高度同源的蛋白在抗病毒特异性上的功能分化，为理解ISG家族的进化和功能专化提供了新视角。机制上，研究不仅证实了SAMD9L作为“翻译抑制型”ISG的作用，还首次在其抗病毒功能与PRR样免疫激活功能之间划清了界限，明确了在抗黄病毒情境下前者是主要机制。这加深了我们对宿主如何利用多功能蛋白进行多层次防御的理解。

其应用价值在于：SAMD9L作为宿主固有的强效抗病毒因子，其作用机制（靶向病毒翻译）为开发新型抗病毒策略（例如，设计模拟或增强其功能的小分子）提供了潜在的靶点。理解SAMD9L在髓系细胞中的关键作用，也有助于阐释黄病毒（尤其是神经侵袭性病毒如WNV）的发病机制和个体易感性差异。

五、 研究亮点

本研究的亮点包括：1）重要的发现：首次系统证实并深入阐明了SAMD9L作为广谱黄病毒限制因子的作用及其独立于免疫激活的独特机制。2）严谨与多层次的方法学：研究流程设计逻辑严密，从筛选验证、细胞系研究到原代靶细胞功能验证，从表型观察到精细的机制剖析（特别是利用RVPs、直接RNA转染和体外转录报告系统精确定位翻译步骤），并采用了遗传学（LOF突变、shRNA敲低）和药理学（鲁索替尼阻断）手段进行因果验证，证据链完整。3）对矛盾现象的深入探究：针对“SAMD9能体外抑制翻译却不能在感染中抑制病毒”这一矛盾现象进行了报道和讨论，提出了合理的假设（病毒特异性激活或病毒逃逸机制），为后续研究指明了方向。4）澄清了蛋白质标签的影响：研究过程中敏锐地观察到并验证了蛋白质标签位置对SAMD9L免疫激活功能的影响，这一发现对领域内未来实验设计具有重要的提醒和参考价值。