本研究由多伦多大学病童医院（The Hospital for Sick Children）的Aleixo M. Muise、波士顿儿童医院的Jay R. Thiagarajah以及加州大学洛杉矶分校的Martín G. Martín作为共同通讯作者主导完成。研究以“The Genetic Architecture of Congenital Diarrhea and Enteropathy”为题，发表于2025年4月3日的《新英格兰医学杂志》（New England Journal of Medicine），卷392，期13，页码1297至1309。该研究由PediCODE联盟（Pediatric Congenital Diarrhea and Enteropathies, www.pedicode.org）的多家成员机构协作完成，涵盖美国、加拿大、以色列、新西兰及比利时等地的临床与科研单位。
先天性腹泻与肠病（congenital diarrhea and enteropathies, CODE）是一组罕见的、主要影响肠上皮细胞功能的遗传异质性疾病，通常在婴儿期发病，表现为慢性腹泻和生长迟缓，具有较高的致残率和死亡率。已知的致病基因可按分子机制分为五类：上皮营养物质/电解质转运缺陷、酶与代谢异常、细胞内运输与细胞极性障碍、内分泌细胞功能异常以及免疫失调相关肠病。此前已明确的致病基因包括MYO5B（微绒毛包涵体病）、EPCAM（簇绒肠病）、NEUROG3（肠内分泌细胞缺乏症）、DGAT1（蛋白丢失性肠病）以及SLC9A3（先天性钠性腹泻）等。
尽管靶向治疗已开始出现，但CODE的总体诊断率和遗传结构仍不明确。以往关于单基因炎症性肠病的大规模研究诊断率仅约4%，少数单中心CODE研究样本量也极为有限。因此，本研究旨在通过多中心、大规模病例系列系统描绘CODE的遗传结构，识别已知致病基因的变异谱，并利用细胞模型与斑马鱼模型发现和验证新的CODE致病基因。
本研究共纳入139名临床诊断为先天性腹泻的婴儿（包括10对同胞），以及182名未患病的父母和同胞。所有样本来自PediCODE联盟成员单位，采用统一的NIH伦理协议（IRB-p00027983）及加拿大病童医院伦理协议（REB 1000072542）。在129个先证者家系中，98个家系除先证者外至少还有一名家庭成员完成了外显子组测序，以辅助遗传诊断。14名先证者来自近亲婚配家庭。
研究流程可分为四个主要环节。第一步是全外显子组或全基因组测序。研究首先利用GEMINI软件系统，基于OMIM数据库中已知CODE致病基因的遗传模式，筛选罕见（gnomAD等位基因频率小于0.01）且有害（CADD评分大于20）的变异。随后进行人工过滤，依据遗传模式、家系共分离、ClinVar注释、临床表型匹配以及ACMG/AMP分类标准，确定致病性或可能致病性变异。对于外显子组测序未发现因果变异的部分病例，进一步行全基因组测序或Sanger测序以弥补覆盖不足或结构变异漏检。
第二步是寻找全新候选基因。在排除已知基因后，研究团队根据遗传遗传度、人群频率、CADD评分、已知基因功能及动物模型可用性，从剩余病例中筛选出三个新的候选CODE基因：GRWD1、MYO1A和MON1A。
第三步是利用细胞模型对候选变异进行功能验证。针对GRWD1变异，研究采用了邻近依赖性生物素标记技术（BioID）在HEK293细胞中比较野生型与变异型蛋白的相互作用组差异，并通过亲和纯化与Western blot验证RPL3结合变化；通过免疫荧光观察变异蛋白的亚细胞定位改变。针对MYO1A变异，研究在Caco-2BBe肠上皮单层细胞中过表达野生型与变异型蛋白，利用共聚焦显微镜和Pearson相关系数定量分析蛋白与微绒毛肌动蛋白骨架的共定位。针对MON1A变异，同样利用BioID在HT-29细胞中分析变异蛋白与Rab7相关内吞运输调控因子的相互作用变化，并在MDCK-FcRn细胞中检测IgG跨细胞转运功能，同时在HT-29细胞中评估内溶酶体酸化能力。
第四步是构建斑马鱼疾病模型。对于GRWD1，由于纯合敲除致死，研究通过CRISPR-Cas9系统构建了F0嵌合突变体（crispant），在受精后8天观察肠道长度与组织形态，并进行RNA测序与差异表达分析。对于MON1A，研究构建了稳定的纯合敲除斑马鱼，在受精后6天和9天分别检测溶酶体活性与黏液分泌表型。
在129个先证者家系中，62例（48%）获得了明确遗传诊断，涉及24个已知CODE致病基因。其中58例（94%）为常染色体隐性遗传，4例（6%）为X连锁遗传。最主要的致病基因集中于上皮运输与极性相关通路：EPCAM（12例）、MYO5B（8例）、TTC7A（4例）、SKIV2L（3例），以及SLC9A3（5例）、DGAT1（5例）、XIAP（4例）和NEUROG3（3例）。仅这8个基因就贡献了52例（占已诊断病例的74%）。
值得关注的是，研究发现了三个外显子组测序漏诊的病例：一名XIAP缺失患者需通过全基因组测序识别；一名PERCC1变异患者因该基因此前未注释而未被全外显子组捕获；一名SLC9A3内含子剪接供体位点变异因外显子8覆盖不足而漏检。此外，MYO5B外显子1存在系统性覆盖不足，提示对高度疑似微绒毛包涵体病但外显子测序阴性的患者应考虑深度补测。
研究还发现了一个新的NEUROG3奠基者变异（Q137R），存在于3个无血缘关系的贝都因家系中；同时在6个阿拉伯海湾地区簇绒肠病家系中确认了已报道的EPCAM奠基者变异（Q167Pfs*21）。
在一对患有先天性腹泻并伴有弥漫性动脉发育不良的同胞中，鉴定出GRWD1复合杂合变异（母源H307R与父源V368F，CADD评分均为25）。GRWD1是WD40蛋白家族成员，参与核糖体大亚基的晚期组装并调控p53。斑马鱼crispant模型显示肠道长度显著缩短，杯状细胞增大且形态异常，肠上皮排列紊乱。RNA测序显示核糖体蛋白基因与p53信号通路基因表达紊乱，提示核仁监视通路被激活。BioID结果显示两种变异蛋白与RPL3及多个核糖体组装因子的结合显著降低，而与prefoldin和CCT伴侣蛋白家族结合增强；变异蛋白在HeLa细胞中由细胞核错误定位至细胞质。这些结果表明GRWD1缺乏导致核糖体生物合成缺陷和肠道杯状细胞功能障碍。
一名2月龄起病的男性患儿携带MYO1A复合杂合变异（父源I678F与母源D240N）。MYO1A是肠道特异性的肌动蛋白基单体马达蛋白，几乎完全定位于肠上皮刷状缘。患儿的十二指肠活检显示肠细胞呈泪滴状紧密排列，刷状缘MYO1A表达减少。在Caco-2BBe细胞中，两种变异蛋白均丧失在顶端微绒毛的富集定位能力，与F-肌动蛋白的共定位显著降低。该患儿的腹泻在2岁时自行缓解，与Myo1a敲除小鼠中其他I类肌球蛋白代偿性重分布的表型一致。
一名近亲婚配家庭的女婴在生后第3天起出现严重腹泻，检测出MON1A纯合变异（R249C，CADD评分27）。MON1A与CCZ1形成鸟苷酸交换因子复合物，调控Rab7A介导的晚期内吞运输。BioID显示R249C变异虽保持与CCZ1B的结合，但与多个Rab7A内吞运输调控因子的结合显著减少。患儿十二指肠活检显示NHE3和ezrin从顶端刷状缘错误定位，Rab7阳性囊泡数量显著减少。体外实验表明R249C变异导致Rab7阳性囊泡变小变少、内溶酶体酸化障碍，以及MDCK-FcRn细胞中双向IgG转胞吞功能减低。纯合MON1A敲除斑马鱼表现出杯状细胞黏液高分泌和富含溶酶体的吸收性肠细胞活性降低。
本研究在迄今最大规模的CODE病例系列中系统描绘了该病的遗传结构，明确了约50%的诊断率，显著高于单基因炎症性肠病及其他单基因疾病的诊断率。研究不仅确认了已知致病基因的变异谱和遗传模式，还发现了新的NEUROG3奠基者变异，并鉴定和功能性验证了三个新的CODE致病基因——GRWD1、MYO1A和MON1A。这些发现拓展了CODE的分子机制谱，提示核糖体生物合成、刷状缘肌动蛋白动力学以及内吞-溶酶体运输在肠上皮功能维持中的关键作用。对于临床实践而言，该研究强调了全基因组测序和深度补测在提高诊断率中的价值，并为未来针对特定分子通路的靶向治疗策略奠定了基础。
本研究的突出之处体现在三个方面。第一，研究采用了系统的多中心协作框架，统一伦理协议与生物信息学流程，样本覆盖了具有广泛祖先多样性的群体。第二，研究综合运用BioID相互作用组分析、多种肠上皮细胞模型和CRISPR-Cas9斑马鱼模型，对三个新基因进行了从分子相互作用到整体肠道表型的多层次功能验证，完成了从基因变异到疾病表型的逻辑闭环。第三，研究首次证明GRWD1和MON1A为CODE的致病基因，并将MYO1A的人类疾病表型从动物模型扩展至临床病例，为后续基因型-表型相关性研究及精准治疗探索提供了新靶点。