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研究的主要作者、机构及发表信息
本研究的主要作者包括Karin Sebald、Andreas Dunkel、Johannes Schäfer、Jörg Hinrichs和Thomas Hofmann，他们分别隶属于慕尼黑工业大学食品化学与分子感官科学系、莱布尼茨食品系统生物学研究所（位于慕尼黑工业大学）、霍恩海姆大学食品科学与生物技术研究所，以及巴伐利亚生物分子质谱中心。该研究发表于《Journal of Agricultural and Food Chemistry》期刊，并于2018年10月5日在线发布。
学术背景与研究目的
发酵食品因其诱人的风味而受到全球消费者的喜爱，例如奶酪、酸奶、可可、腌制火腿、酱油等。然而，尽管过去40年间已有多项研究致力于解析挥发性食品气味的组合代码，但对于非挥发性关键肽如何通过酶解蛋白质影响发酵食品典型风味的知识仍较为零散。尤其是苦味肽的研究，由于发酵食品中肽种类繁多且复杂，传统方法难以高效分离和鉴定这些活性肽。因此，本研究旨在开发一种新方法——“Sensoproteomics”（感官蛋白组学），用于快速识别发酵食品中的关键苦味肽，并应用于新鲜奶酪样品的分析，以揭示其苦味形成机制。
研究工作流程
本研究分为多个步骤进行：
样品准备与提取
研究选取了两种新鲜奶酪样品（fc9和afc9），并通过超滤将水溶性提取物（WSE）分离为低分子量（LMW）和高分子量（HMW）两部分。随后，采用MPLC（中压液相色谱）对HMW部分进行分级，并通过Taste Dilution Analysis（TDA，味觉稀释分析）筛选出具有强烈苦味的MPLC级分（m2-m4）。
肽段数据库构建与筛选
通过对文献进行元分析，研究团队构建了一个包含约1600种候选肽的数据库，这些肽来源于牛乳酪蛋白（αs1-、β-和κ-casein）。使用Skyline软件生成了34,300个质量转换参数，并设计了120种Selected Reaction Monitoring（SRM，选择反应监测）方法。这些方法被用于UPLC-MS/MS（超高效液相色谱-串联质谱）分析，以筛查奶酪样品中的候选肽。
数据过滤与验证
数据经过三步过滤：首先保留那些在afc9样品中浓度比fc9高出3倍以上的肽；其次仅保留信噪比≥10的肽；最后只考虑出现在苦味级分m2-m4中的肽。最终从340种候选肽中筛选出23种潜在苦味肽。这些肽进一步通过合成标准品验证，最终确认了17种苦味肽。
定量分析与阈值测定
使用外标法对奶酪样品中的目标肽进行准确定量，并通过3-AFC测试（三选一强制选择测试）测定了每种肽的苦味阈值。此外，计算了每种肽的剂量/阈值因子（DOT），以评估其对整体苦味的贡献。
工艺过程追踪
在奶酪制造的不同阶段取样，通过LC-MS/MS-MRM（多重反应监测）定量分析目标肽的变化情况，绘制了热图以展示各阶段肽浓度的动态变化。
主要结果
1. 样品感官评价与提取物分析
感官评价显示，afc9和afc12样品的苦味强度显著高于fc9样品，分别为2.0和2.6（评分范围0-5）。水溶性提取物（WSE）是苦味肽的主要来源，而甲醇提取物（ME）则几乎没有苦味。超滤结果显示，高分子量部分（HMW）具有更高的苦味强度（评分为3.1），而低分子量部分（LMW）仅表现出轻微苦味。
MPLC-TDA筛选与UPLC-TOF-MS分析
MPLC分级后得到六个子级分（m1-m6），其中m2、m3和m4表现出最高的味觉稀释因子（TD-Factor），分别为8、2和16。UPLC-TOF-MS分析表明，这些级分中包含数百种肽信号，进一步验证了其复杂性。
候选肽的筛选与验证
通过SRM方法筛查，从afc9样品中共检测到340种候选肽，经数据过滤后保留了23种肽，最终通过合成标准品验证确认了17种苦味肽。这些肽主要来源于β-casein和κ-casein，而未发现来自αs2-casein的肽。
苦味阈值与定量分析
苦味阈值测定显示，ARHPHPHLSFM（κ-CN96-106）的阈值最低（30 µmol/L），而IQKEDVPS（αs1-CN81-88）的阈值最高（690 µmol/L）。定量分析表明，MAPKHKEMPFPKYPVEPF（β-CN102-119）和ARHPHPHLSFM（κ-CN96-106）在afc12样品中的浓度最高，分别为86.8 µmol/kg和28.5 µmol/kg，其DOT因子分别为1.0和1.0，表明它们对苦味感知的主要贡献。
工艺过程追踪
热图分析显示，发酵过程中添加乳酸菌启动培养物后，目标肽的生成显著增加。例如，在afc9工艺中，VLPVPQ的浓度从0.4 µmol/kg增加到1.8 µmol/kg，而在fc9工艺中，KVLPVPQKAVPYPQ的浓度则从1.7 µmol/kg增加到12.9 µmol/kg。
结论与价值
本研究成功开发了一种名为“Sensoproteomics”的新方法，结合感官导向分析与靶向蛋白组学技术，快速识别了新鲜奶酪中的关键苦味肽。研究表明，MAPKHKEMPFPKYPVEPF和ARHPHPHLSFM是主要的苦味贡献者，其生成受发酵工艺和蛋白质含量的影响显著。这一方法不仅为发酵食品中活性肽的快速鉴定提供了新途径，还为优化食品加工工艺、改善产品风味奠定了基础。
研究亮点
1. 首次提出并应用“Sensoproteomics”方法，显著提高了苦味肽鉴定的效率。
2. 发现κ-casein作为苦味肽来源的新角色，拓展了对奶酪苦味形成机制的认识。
3. 结合多种先进技术（如SRM、UPLC-MS/MS），实现了对复杂食品体系中活性肽的全面解析。
其他有价值内容
研究还强调了不同加工工艺对苦味肽生成的影响，为工业生产中控制奶酪苦味提供了重要参考。此外，通过剂量/阈值因子分析，明确了亚阈值肽对整体苦味感知的协同作用，为进一步研究食品风味的复杂性提供了新思路。