本研究的主要作者包括魏海霞、谢安琪、李家杰、方超、刘琳、邢俊敏、施飞虎、莫峰、陈殿辉、谢红艳、杨泉、潘兴飞（通讯作者）、汤晓平（通讯作者）和黄俊（通讯作者）。作者单位包括广州医科大学附属第三医院传染病科、广东省重大产科疾病重点实验室、广州医科大学中法霍夫曼研究所基础医学部、广州医科大学附属广州市第八人民医院以及广州医科大学基础医学院蛋白质修饰与降解广州市重点实验室和广东省重点实验室。
该研究于2022年8月24日发表在开放获取期刊 Frontiers in Immunology 的“寄生虫免疫学”专题栏目中，文章标题为“PD-1+ CD4 T cell immune response is mediated by HIF-1a/NFATc1 pathway after P. yoelii infection”，引用信息为：Wei H, Xie A, Li J et al. (2022) Front. Immunol. 13:942862。
本研究属于免疫学，具体为疟疾感染免疫研究领域。其学术背景在于：疟疾仍是全球性的重大健康威胁，其发病率和死亡率居高不下。在抗疟免疫中，T细胞，特别是CD4 T细胞，发挥着核心作用。程序性死亡受体-1（Programmed cell death-1， PD-1）是重要的共抑制分子。在慢性病毒感染和肿瘤中，表达PD-1的CD8 T细胞常表现为功能耗竭。然而，在疟疾感染中，CD4 T细胞表达PD-1所扮演的角色，以及调控CD4 T细胞中PD-1表达的上游分子机制，尚不明确。同时，贫血是急性疟疾的常见症状，可能导致机体缺氧环境，而缺氧诱导因子-1α（Hypoxia inducible factor-1α， HIF-1α）是细胞应答缺氧的关键转录因子。本研究旨在探究约氏疟原虫（Plasmodium yoelii， P. yoelii）感染小鼠模型中，脾脏PD-1+ CD4 T细胞的表型、功能及其上游调控通路，特别是HIF-1α和活化T细胞核因子1（Nuclear factor of activated T cells 1， NFATc1）的作用，以期为了解疟疾免疫病理和开发新的免疫治疗策略提供依据。
研究的详细工作流程如下：首先，建立动物模型。使用6-8周龄雌性C57BL/6小鼠，腹腔注射感染1×10^6个感染约氏疟原虫的红细胞。感染后第12天（部分动态观察实验持续至28天）处死小鼠，获取脾脏。其次，分离与分析脾脏淋巴细胞。手术摘取脾脏称重，机械研磨并通过细胞筛网过滤，使用红细胞裂解液去除红细胞，获得脾脏单细胞悬液。研究采用的主要技术手段包括流式细胞术（Flow cytometry， FCM）、细胞分选、微阵列转录组测序、蛋白质印迹（Western blot）、染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation， Chip）、小干扰RNA（siRNA）转染以及定量PCR（qPCR）。具体流程可分为几个关键步骤： 1. 表型与功能分析：通过多色流式细胞术，检测感染前后小鼠脾脏淋巴细胞中PD-1的表达情况，分析PD-1+细胞群的组成（CD4 T、CD8 T、B细胞、CD11b+细胞等），并动态观察感染后PD-1+ CD4 T细胞比例的变化（0-28天）。同时，检测PD-1+和PD-1- CD4 T细胞表面活化标记物（CD62L、CD69、CD40L、CD25、CXCR5）的表达差异，以及经PMA/离子霉素刺激后细胞内细胞因子（IFN-γ、IL-17、IL-2、IL-10、IL-4）的产生能力。每个实验组通常使用3-7只小鼠样本，并重复实验三次。 2. 转录组学筛选：为了全面了解PD-1+ CD4 T细胞的功能及寻找潜在的上游调控基因，研究使用流式分选技术从感染小鼠脾脏中纯化出PD-1+和PD-1- CD4 T细胞，送至北京博奥晶典生物技术有限公司进行微阵列基因表达谱检测。通过筛选表达差异倍数（Fold change， FC）≥2或≤0.5且p<0.05的基因，获得差异表达基因集，并进行基因本体（Gene Ontology， GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes， KEGG）通路富集分析。 3. 上游转录因子验证：基于文献报道和转录组数据，聚焦于可能调控PD-1的转录因子。流式细胞术检测NFATc1在PD-1+/- CD4 T细胞中的表达及动态变化。通过蛋白质印迹分析PD-1+和PD-1- CD4 T细胞中NFATc1在胞浆和胞核的分布。采用染色质免疫共沉淀技术，使用抗NFATc1抗体富集其与PD-1启动子区结合的DNA片段，并通过qPCR验证结合效率。在体外，使用抗CD3/CD28抗体刺激分选的CD4 T细胞，观察NFATc1和PD-1表达的上调；随后转染针对Nfatc1的siRNA，验证敲低NFATc1对PD-1表达的影响。 4. 缺氧通路探究：检测感染小鼠外周血红细胞密度，分析其与CD4 T细胞中PD-1、NFATc1表达的相关性。通过流式细胞术检测HIF-1α在PD-1+/- CD4 T细胞中的表达。在体外，使用氯化钴（CoCl2， 400 μM）模拟缺氧条件处理分选的CD4 T细胞，诱导HIF-1α表达，观察对NFATc1和PD-1的影响；同时加入HIF-1α特异性抑制剂YC-1（1 mM），逆转上述效应。在体内，对感染约氏疟原虫的小鼠每日注射YC-1（10 mg/kg），感染后第12天分析脾脏大小、重量、血清IgG水平，并通过流式细胞术检测脾脏CD4 T细胞中HIF-1α、NFATc1、PD-1的表达，以及活化标记和细胞因子分泌的变化。
本研究未涉及全新的自创实验方法或设备，但综合运用了多种成熟的免疫学和分子生物学技术，其数据分析主要使用Prism软件进行双尾Student‘s t检验，多组比较采用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，p < 0.05认为具有统计学显著性。
研究取得的主要结果如下： 1. P. yoelii感染诱导脾脏CD4 T细胞PD-1表达上调：感染后小鼠脾脏显著增大增重。流式和qPCR结果均显示，感染小鼠脾脏淋巴细胞PD-1表达高于未感染组。PD-1+细胞群组成分析表明，CD4 T细胞是感染后PD-1表达的主要细胞类型之一。动态观察发现，感染后脾脏PD-1+ CD4 T细胞比例随时间延长而显著增加，在第16天达到峰值（约80%），随后逐渐下降。 2. PD-1+ CD4 T细胞表现为活化表型且分泌更多细胞因子：与PD-1- CD4 T细胞相比，感染小鼠中的PD-1+ CD4 T细胞表达更少的CD62L（一种初始/中央记忆T细胞标记）和更多的CD69（早期活化标记）、CXCR5（滤泡辅助T细胞标记）。细胞因子检测显示，在感染小鼠中，PD-1+ CD4 T细胞分泌IFN-γ、IL-10、IL-2和IL-4的比例显著高于PD-1- CD4 T细胞。这些结果表明PD-1+ CD4 T细胞并非耗竭，而是处于更活跃的状态。 3. 转录组学分析提示PD-1+ CD4 T细胞功能活跃并聚焦NFATc1：微阵列测序在PD-1+ CD4 T细胞中鉴定出309个上调基因和225个下调基因。GO和KEGG分析显示这些差异基因主要富集于“免疫应答”、“炎症反应”、“B细胞活化”、“淋巴细胞增殖”等通路。数据进一步证实PD-1+ CD4 T细胞高表达CXCR3、CXCR5、ICOS等活化分子，以及IL-10、IL-21、IL-4、IL-2、IFN-γ等细胞因子。在已知的10个PD-1转录调控因子中，NFATc1在PD-1+与PD-1- CD4 T细胞间的表达差异最为显著，且是上调的转录激活因子，提示其可能是关键的上游调控因子。 4. NFATc1是感染后诱导PD-1表达的关键转录因子：流式检测证实，仅在感染小鼠的PD-1+ CD4 T细胞中能检测到NFATc1表达，其动态变化趋势与PD-1相似。蛋白质印迹显示，感染小鼠PD-1+ CD4 T细胞中NFATc1表达更高，且主要位于细胞核内。染色质免疫共沉淀实验证明，感染后NFATc1与PD-1启动子区的结合效率显著高于未感染小鼠。体外实验表明，CD3/CD28抗体刺激可上调CD4 T细胞中NFATc1和PD-1的表达，而用siRNA敲低NFATc1则可下调PD-1的表达。这些结果确立了NFATc1在P. yoelii感染后直接结合并启动PD-1表达的关键作用。 5. HIF-1α通过NFATc1调控PD-1表达：相关性分析显示，感染小鼠CD4 T细胞中PD-1和NFATc1的表达水平与红细胞密度呈负相关，提示其可能与缺氧有关。流式检测发现HIF-1α仅在感染小鼠的PD-1+ CD4 T细胞中高表达。体外实验中，CoCl2诱导的缺氧条件可上调CD4 T细胞中HIF-1α、NFATc1和PD-1的表达，而加入HIF-1α抑制剂YC-1可逆转此效应。在体实验中，对感染小鼠施用YC-1，可导致脾脏缩小，并下调脾脏CD4 T细胞中HIF-1α、NFATc1和PD-1的表达。此外，YC-1处理组小鼠血清中特异性IgG水平更高，且脾脏CD4 T细胞中分泌IL-10的比例增加。这些结果证明，在P. yoelii感染背景下，HIF-1α是NFATc1和PD-1表达的上游调控分子。
本研究得出的核心结论是：约氏疟原虫感染通过诱导缺氧环境，上调CD4 T细胞中的HIF-1α。高表达的HIF-1α进而促进NFATc1的表达。NFATc1进入细胞核，直接结合并启动PD-1基因的表达。在疟疾感染中，PD-1+ CD4 T细胞并非功能耗竭，而是表现出更强的活化状态和细胞因子分泌能力（如IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10），从而在调控宿主抗疟免疫应答中发挥重要作用。
该研究的科学价值在于：首次在疟疾感染模型中系统阐述了PD-1+ CD4 T细胞的活化性表型与功能，挑战了PD-1单纯作为T细胞耗竭标志的传统观念在疟疾语境下的普适性。更重要的是，它揭示了一条全新的调控通路：HIF-1α/NFATc1/PD-1轴，将疟疾感染导致的病理生理变化（贫血、缺氧）与T细胞的免疫调控分子（PD-1）直接联系起来，为理解疟疾免疫病理的分子机制提供了新视角。其应用潜力体现在：HIF-1α或NFATc1可能成为干预疟疾免疫应答的新靶点，例如，通过调节该通路来优化抗疟免疫反应或缓解免疫病理损伤，为未来开发基于免疫调节的疟疾辅助治疗策略提供了理论依据。
本研究的亮点包括：1. 重要发现：明确了疟疾感染中PD-1+ CD4 T细胞的活化属性，并首次报道HIF-1α是PD-1的上游调控分子，阐明了“缺氧-HIF-1α-NFATc1-PD-1”这一完整的信号传导通路。2. 研究方法的综合性：研究并未依赖单一技术，而是有机结合了体内动物模型、多参数流式分析、转录组学、分子互作验证（Chip）和功能获得/丧失实验（激动剂/抑制剂、siRNA），形成了完整的证据链，使结论非常坚实。3. 临床关联性：研究从疟疾的常见临床症状（贫血）出发，推导出缺氧通路，并将基础分子机制与整体免疫表型、甚至血清学指标（IgG）相联系，增强了研究的生理和病理相关性。
其他有价值的内容包括：研究还观察了PD-1+细胞群组成的动态变化，发现感染后B细胞中PD-1+比例下降，而CD8 T和CD11b+细胞中PD-1+比例上升，提示PD-1在不同免疫细胞亚群中的调控可能存在差异。此外，使用HIF-1α抑制剂YC-1处理后，虽然抑制了PD-1表达和部分活化标记（CD69），但增强了体液免疫（IgG升高）和抗炎因子IL-10的产生，这提示精细调控该通路可能对平衡抗疟免疫的保护作用和病理损伤具有潜在意义，值得进一步探索。