本文由Aida Cardona-Alberich, Manon Tourbez, Sarah F. Pearce 和 Christopher R. Sibley合作撰写，发表于《RNA Biology》期刊，并于2021年1月27日在线发表。作者们来自英国爱丁堡大学的多家研究机构，包括定量生物学、生物化学与生物技术研究所，西蒙发展脑科学倡议中心，发现脑科学中心以及Euan MacDonald运动神经元病研究中心。这是一篇关于单细胞RNA测序技术及其在脑科学研究中应用的综述文章。
本文的核心主题是系统性地回顾和阐述单细胞RNA测序技术在过去十年中的发展、成熟及其在揭示大脑细胞动态方面的革命性应用。文章旨在向读者全面介绍scRNA-seq的技术原理、不同技术变体的特点、生物信息学挑战，并重点综述了该技术在神经科学领域，特别是在神经发育障碍和神经退行性疾病研究中已取得的突破性发现。
单细胞RNA测序技术原理与发展历程 文章首先详细介绍了scRNA-seq的技术基础。该技术起源于20世纪90年代Norman Iscove和James Eberwine的开创性工作，其核心目标是在单个细胞分辨率上解析RNA代谢。现代scRNA-seq工作流程通常包括：将样本解离成单细胞、为每个细胞的RNA标记上独特的细胞条形码、对低丰度的细胞RNA进行扩增、构建测序文库并进行高通量测序。文章指出，2011年引入细胞条形码概念的STRT-seq协议是推动该领域方法学革命的关键，它使得从同一数据集中区分不同细胞的转录组成为可能。
当前不同的scRNA-seq协议变体主要在五个方面存在差异：(1) 标记单个细胞RNA的方法（细胞条形码），(2) 扩增低丰度细胞RNA的方法，(3) 富集和测序的mRNA转录本区域，(4) 捕获和处理单个细胞的方法，以及(5) 起始材料的选择（全细胞或细胞核）。文章通过图示和文字详细解释了这些差异。例如，细胞条形码可以通过物理隔离细胞到独立孔中进行“后期索引”，也可以通过将条形码序列引入逆转录引物中进行“早期索引”，后者允许更早地进行样本多重测序，提高了通量并降低了成本。此外，引入独特分子标识符用于分子计数，提高了基因定量，特别是低丰度转录本定量的可重复性。
在扩增方法上，文章比较了体外转录的线性扩增和基于PCR的指数扩增各自的优缺点。IVT能更好地保持mRNA转录本的相对丰度，但过程繁琐；而PCR方法（如SMART-seq系列）更易实施，但存在模板转换效率低和扩增偏向性等问题。文章还介绍了等温滚环扩增等新兴方法。
关于转录本覆盖范围，文章区分了能够获得全长转录本覆盖但通量相对较低的“全长”方法，以及主要富集mRNA 3‘端或5’端、从而实现高通量测序的“末端富集”方法。后者更适合于研究细胞异质性和差异基因表达，而前者在分析异构体使用和pre-mRNA剪接事件方面具有优势。文章也提及了长读长测序技术（如Oxford Nanopore和PacBio）在未来单细胞异构体研究中的潜力。
技术规模化与起始材料选择 为了应对规模化挑战，文章概述了三种主要的高通量捕获策略：基于微孔阵列的方法、基于微流控液滴的方法以及基于原位条形码标记的方法（如Split-seq）。液滴法（如10x Genomics平台）因其可扩展性和商业化程度已成为生命科学领域的流行方法。而原位方法则无需特殊设备，成本效益高，已实现单次实验分析超过15万个细胞。
文章特别强调了单核RNA测序作为研究复杂组织（如成年哺乳动物大脑）的重要替代方案。由于神经元具有长轴突和复杂连接，将成年脑组织解离成完整的单细胞悬液极具挑战性。snRNA-seq使用更温和的方法分离细胞核，已证明其与scRNA-seq在基因表达特征上具有良好的一致性，为利用人类脑库资源研究神经系统疾病提供了前所未有的机会。
单细胞多组学与生物信息学 文章简要介绍了单细胞多组学技术，例如并行处理基因组和转录组的G&T-seq，以及同时分析细胞表面蛋白组和转录组的CITE-seq，这些技术能从同一细胞获取更全面的信息。
针对scRNA-seq实验产生的大规模测序数据，文章指出生物信息学分析是关键环节。标准分析流程包括质量控制、数据预处理（如解复用、基因组比对、标准化、校正、特征选择、降维）和下游分析。已有多个整合良好的分析流程（如Cell Ranger, Seurat）可供使用。下游分析则可能涉及更精细的细胞聚类、轨迹推断、差异基因表达分析和基因调控网络推断等。研究者需要根据其数据集和生物学问题谨慎选择最合适的工具。
单细胞转录组学在哺乳动物中枢神经系统的应用与发现 文章的第二大部分系统综述了scRNA/snRNA-seq技术在神经科学，特别是在神经发育障碍和神经退行性疾病研究中的应用与重要发现。
揭示神经系统的细胞多样性 应用scRNA/snRNA-seq技术对小鼠和人类大脑不同区域、不同发育阶段进行的研究，极大地扩展了我们对中枢神经系统细胞类型复杂性的认知。这些研究不仅确认了已知的细胞类型，还发现了许多新的细胞亚群，为理解大脑在健康和疾病状态下的功能提供了前所未有的细胞图谱基础。文章通过一个路线图（图2）和表格（表2）总结了相关研究。
神经发育障碍的洞察 文章以自闭症谱系障碍、Rett综合征、寨卡病毒感染和癫痫发作活动为例，说明了scRNA-seq如何提供新的见解。 * 自闭症谱系障碍：通过分析健康成人和胎儿大脑的单细胞数据，研究者发现ASD风险基因在发育中的兴奋性谷氨酸能神经元中富集，但也存在于少突胶质前体细胞和周细胞等非神经元细胞中，提示神经胶质和血脑屏障可能参与ASD病因。对ASD患者死后前额叶皮层和扣带回皮层的snRNA-seq分析进一步揭示了疾病状态下特定的细胞类型比例变化（如原生质星形胶质细胞和第四层兴奋性神经元增加）以及细胞类型特异性的差异基因表达，这些变化与ASD表型严重程度相关，且大部分独立于共病的癫痫活动。 * Rett综合征：利用snRNA-seq结合“SNP-seq”分析方法，研究者能够在携带MECP2基因突变的女性患者（存在X染色体随机失活导致的细胞嵌合现象）的脑组织中，区分表达野生型或突变型MECP2蛋白的单个细胞的转录组。这允许同时研究细胞自主性和非细胞自主性的转录组特征，揭示了MECP2缺失在兴奋性神经元中导致的细胞自主性长基因上调，以及在野生型神经元中观察到的非细胞自主性变化。 * 寨卡病毒：通过分析人类胎儿皮层scRNA-seq数据，研究者发现病毒进入受体AXL在放射状胶质细胞（神经前体细胞）中特异性高表达，而在成熟神经元中不表达。这为寨卡病毒为何特异性地影响发育中大脑并导致小头畸形提供了可能的分子解释，尽管后续研究对AXL的必要性提出了疑问。 * 癫痫发作：文章介绍了act-seq技术，该技术通过使用转录抑制剂放线菌素D和降低制备温度，最大限度地减少了组织解离过程中人为诱导的立即早期基因表达。这使得研究人员能够更灵敏地检测小鼠内侧杏仁核中化学诱导癫痫发作后，不同细胞类型（神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞等）中特异性的IEG诱导程序，揭示了只有每种细胞类型中的一部分亚群被激活。
神经退行性疾病研究的进展 scRNA-seq在神经退行性疾病研究中的应用主要围绕三个主题展开：发现新的疾病相关细胞状态、揭示疾病的分子特征和机制、以及描绘疾病进展的转录组动态。 * 疾病相关细胞状态：在阿尔茨海默病小鼠模型（5xFAD）中，scRNA-seq鉴定出一种新的小胶质细胞状态，称为“疾病相关小胶质细胞”（DAM）。DAM与稳态小胶质细胞关系密切，但表达谱不同，其激活分为TREM2依赖和非依赖的两步过程，并定位于Aβ斑块周围。类似地，在同一个模型中发现了“疾病相关星形胶质细胞”（DAA），其表达与补体级联和衰老相关的独特基因。在多发性硬化症的小鼠模型和患者组织中，也发现了疾病特异性的少突胶质细胞谱系细胞状态。这些发现揭示了神经胶质细胞在疾病中活跃且复杂的作用，超越了其传统支持细胞的角色。 * 分子特征与机制：通过对DAM的深入分析，研究者明确了TREM2基因在DAM完全激活中的关键作用。对人类AD脑组织的snRNA-seq研究则提供了更全面的视角，揭示了几乎所有主要细胞类型在AD中都存在转录水平的变化，且这些变化具有细胞类型特异性。例如，APOE基因在AD小胶质细胞中上调，在星形胶质细胞中下调；而LINGO1在兴奋性神经元和少突胶质细胞中上调。研究还发现了一些跨细胞类型的协调性差异表达基因簇，如对拓扑错误蛋白和细胞应激的反应。在MS研究中，scRNA-seq意外地发现少突胶质前体细胞和少突胶质细胞谱系细胞能够表达MHC-I和MHC-II等免疫相关分子，并具备触发T淋巴细胞反应的能力，表明它们可能主动参与疾病的免疫调节，而不仅仅是被动的受害者。 * 疾病进展研究：通过时间分辨的scRNA-seq分析（如对CK-p25神经退行小鼠模型不同时间点的分析），可以追踪小胶质细胞从稳态到反应状态的动态转变过程，识别出早期增殖和晚期免疫反应等不同阶段的特征。此外，利用“伪时间”分析算法（如Wanderlust, Monocle），可以从单一样本的scRNA-seq数据中推断细胞状态转变的轨迹，从而在无需多个时间点样本的情况下研究疾病进展。例如，应用伪时间分析证实了DAM存在中间和晚期两种状态，并揭示了AD中不同小胶质细胞状态的比例发生了定量重分布。类似的分析方法也被应用于帕金森病患者iPSC来源的多巴胺神经元，以研究分子表型的进展。
本文的意义与价值 这篇综述文章具有重要的学术价值。首先，它系统性地梳理了scRNA-seq技术的发展脉络、技术原理和各种变体的优缺点，为神经科学领域的研究者选择合适的技术方案提供了清晰的指南。其次，文章全面总结了该技术在解析大脑细胞多样性、理解神经发育和退行性疾病机制方面的最新突破性成果，展示了单细胞分辨率研究如何颠覆我们对复杂脑疾病中特定细胞类型作用的认识。例如，文章强调的研究发现，如胶质细胞在疾病中的主动免疫调节功能、疾病相关细胞状态的发现、以及跨细胞类型的协调性分子反应等，都是传统批量测序技术难以揭示的。最后，文章展望了空间转录组学、长读长测序、多组学整合等新兴技术与scRNA-seq结合的未来潜力，为领域的发展指明了方向。总而言之，本文不仅是一篇技术综述，更是一份展示单细胞技术如何深刻改变神经科学研究范式的综合性报告，对于推动该领域的发展具有重要的参考和启发意义。