该文档报道了一项单次原创研究，作者为Yuhao Yuan、Yong Zhu、Minning Ou、Yiyang Mao、Zechun Liu、Zhangyuan Lin、Ruibo Zhao、Haitao Long、Zhiyu Hu、Hongbin Guo、Zhong Alan Li、Jianzhong Hu、Hongbin Lu及Can Chen。研究团队主要来自中南大学湘雅医院骨科、国家老年疾病临床医学研究中心、湖南省器官损伤衰老与再生医学重点实验室，以及香港中文大学生物医学工程学系等机构。该研究发表于 Advanced Functional Materials，DOI为10.1002/adfm.202501622，论文编号e01622。

该研究属于骨组织工程与再生医学领域。临床上，临界尺寸骨缺损的修复仍高度依赖自体骨移植，但自体骨来源有限且存在供区并发症。近年来，基于干细胞的骨替代物虽被提出，但存在需要开放手术植入、无法完全填充不规则缺损以及植入干细胞成骨效率不足等问题。为克服上述缺陷，该研究提出构建“微型骨类器官”，使其在体外即具备近似天然骨的细胞外基质和骨细胞表型，从而作为可直接替代自体骨的即用型填充物，并通过微创注射实现不规则缺损的完全填充。研究的核心目标包括：筛选适合构建骨类器官的脱细胞骨基质来源、鉴定具有强成骨潜能的骨髓间充质干细胞亚群，并建立快速生成微型骨类器官的培养方案。

研究流程主要包括四个阶段。第一阶段为筛选骨组织来源。研究者获取大鼠出生后不同发育阶段腰椎椎体，通过micro-CT、组织学染色和免疫荧光染色评估骨形成与血管生成。结果显示青春期椎体骨具有最高的骨体积分数和骨小梁厚度，同时表达最高水平的骨钙素和H型血管标志物。因此，青春期椎体骨被选为制备脱细胞骨基质微粒的原料。第二阶段为制备并评价脱细胞骨基质微粒。研究者将青春期骨基质与成年骨基质分别脱细胞、冻干并研磨成微米级颗粒。DNA定量、扫描电镜、能谱分析和蛋白质组学分析表明，两种微粒均无可见细胞核残留，并保留胶原和矿化成分；青春期骨基质微粒在成骨、血管生成及抗氧化相关蛋白表达上具有优势。第三阶段为鉴定并分选强成骨潜能干细胞亚群。研究者利用公开的单细胞RNA测序数据，对体外培养的人骨髓间充质干细胞进行异质性分析，识别出高表达SOX4、GAS1、DPP4的成骨亚群，并确定以CD34⁻CD45⁻CD105⁺CD26⁺TMEM119⁺为分选方案，通过流式细胞术从骨髓中纯化出成骨性骨髓间充质干细胞。第四阶段为构建并评价微型骨类器官。将分选出的成骨性骨髓间充质干细胞接种于青春期骨基质微粒表面，先在含FGF2的培养基中增殖5天以覆盖微粒，再在含BMP2的成骨诱导培养基中培养9天。该培养方案模拟膜内成骨过程中早期间充质凝聚和晚期骨细胞形成的事件。为验证类器官与天然骨在基因表型上的相似性，研究者对微型骨类器官和去除骨髓的骨小梁进行mRNA测序，并在大鼠股骨缺损模型中通过微创注射评价其体内修复效果。

实验结果显示，青春期椎体骨在不同发育阶段中具有最强的成骨和血管生成活性，为后续脱细胞基质制备提供了组织学依据。脱细胞处理后，青春期骨基质微粒中DNA含量降至29.68 ng mg⁻¹，达到脱细胞基质标准，同时保留大量与骨化、血管生成及抗氧化应激相关的细胞外基质蛋白。蛋白质组学分析鉴定出122种蛋白，其中CTHRC1、FBN2和SPARC在青春期骨基质中显著高表达。体外实验证明，与成年骨基质微粒相比，青春期骨基质微粒能促进骨髓间充质干细胞增殖，提高RUNX2和COL10α1表达，并在皮下植入模型中诱导更多CD31阳性血管长入；此外，青春期骨基质微粒表面细胞的衰老相关β-半乳糖苷酶活性和γH2AX阳性率均低于成年骨基质微粒。通过单细胞RNA测序和流式分选，研究者获得的成骨性骨髓间充质干细胞在成骨诱导后表现出显著更高的RUNX2、COL1α1表达和茜素红染色面积。在类器官构建过程中，鬼笔环肽染色显示细胞在5天内即可完全覆盖微粒表面。mRNA测序显示，微型骨类器官与去除骨髓的骨小梁共有16,256个表达基因，骨细胞标志物表达水平相近，但破骨细胞标志物表达显著较低。KEGG通路富集分析提示PI3K-Akt信号通路在类器官形成过程中可能发挥关键作用。体内实验中，将微型骨类器官注射至大鼠股骨缺损后，术后3周即有大量新骨形成，6周时缺损几乎完全被板层骨填充，其骨体积分数和骨小梁厚度均显著高于PBS组和细胞与微粒混合物组。条件培养基分析表明，微型骨类器官可分泌更高水平的血管生成因子（ANG-5、VEGF-C）和成骨因子（IGF-2、OPG），并能促进人脐静脉内皮细胞成管和骨髓间充质干细胞钙结节沉积。植入后6周，微型骨类器官组在缺损区检测到更多的人源细胞核阳性细胞，提示植入细胞可直接参与骨形成。

该研究得出的结论是：利用青春期骨基质微粒和成骨性骨髓间充质干细胞，通过FGF2早期促增殖和BMP2后期促成骨的两阶段培养方案，可在14天内快速生成微型骨类器官。该类器官在骨细胞表型和骨性细胞外基质方面与天然骨高度相似，并具有旁分泌促血管生成和促成骨功能。在大鼠股骨缺损模型中，类器官经微创注射后6周即可实现缺损的快速修复，表明其可作为即用型骨替代物和旁分泌单元用于骨缺损治疗。该研究的科学价值在于首次提出以青春期骨基质微粒作为类器官培养基质，并利用单细胞测序指导成骨性干细胞亚群分选，从而显著提升骨类器官的构建效率和功能。其应用价值在于为临界尺寸骨缺损提供了一种可微创注射、完全填充缺损且不依赖体内成骨效率的新型治疗策略，有望克服现有干细胞骨替代物的主要局限。

该研究的亮点包括：第一，首次报道青春期骨基质比成年骨基质具有更强的促骨形成、促血管生成和抗衰老功能，为脱细胞基质材料的供体选择提供了新依据；第二，通过单细胞RNA测序解析骨髓间充质干细胞异质性，并建立了成骨性亚群的特异性分选方案；第三，开发了一种模拟膜内成骨的两阶段培养方案，可在14天内快速生成微型骨类器官；第四，证实微型骨类器官可通过微创注射完全填充不规则骨缺损并在6周内实现快速修复，兼具直接成骨和旁分泌调控的双重作用。此外，论文还指出，当前类器官主要模拟骨小梁的细胞外基质和成骨谱系细胞表型，尚未包含骨吸收单位和造血单位，未来结合类器官芯片和人工智能辅助培养设计，有望构建功能更完整的整合骨类器官。