氧化-葡聚糖基抗菌水凝胶的制备与评价及其在协同光动力疗法中的应用
本研究由武汉理工大学化学、化工与生命科学学院的赵雨婷、郭佩勇、李丹、刘梦杰、张俊豪、袁凯、郑华（通讯作者）以及内蒙古医科大学中医学院的刘亮（通讯作者）共同完成。研究成果以题为《Preparation and evaluation of oxidized-dextran based antibacterial hydrogel for synergistic photodynamic therapy》的论文形式，于2023年10月25日在线发表于国际学术期刊《international journal of biological macromolecules》第253卷。
研究背景与目的
本研究隶属于生物医用材料与药物递送交叉领域，核心目标是开发一种新型智能创伤敷料，以应对全球范围内普遍存在的、易继发感染的皮肤创伤治疗难题。皮肤是人体最大且最易受损的器官，急慢性创伤后极易发生细菌感染。临床治疗仍高度依赖抗生素，但单一抗生素抗菌谱有限，难以应对创伤部位复杂的混合菌群（急性创伤以金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌为主，慢性创伤则以大肠杆菌、铜绿假单胞菌等革兰氏阴性菌为主）。此外，抗生素滥用导致的细菌耐药性和毒副作用问题日益严峻。因此，开发能协同作用、覆盖广谱菌群且能减少副作用的新型治疗策略至关重要。
近年来，基于纳米技术的湿性伤口敷料，特别是水凝胶，因其高含水率、良好的生物相容性和模拟细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）的结构而受到广泛关注。其中，葡聚糖（Dextran）作为一种生物相容性高、可生物降解的细菌胞外多糖，是理想的生物材料基体。同时，光动力疗法（Photodynamic Therapy, PDT）作为一种通过光敏剂在特定光照下产生活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）来杀伤病变细胞或细菌的方法，在抗菌领域展现出避免耐药性的独特优势。然而，光敏剂如己基5-氨基酮戊酸酯（Hexyl 5-Aminolevulinate, HAL）存在水溶性差、在生理环境中降解过快、需频繁给药等问题。
基于以上背景，本研究旨在利用创伤微环境呈弱酸性（pH约5.0）的特性，设计并构建一种pH响应的“智能”抗菌水凝胶。该水凝胶以氧化葡聚糖（Oxidized Dextran, ODex）为载体，通过希夫碱（Schiff base）键同时负载抗生素阿米卡星（Amikacin, AMK）和光敏剂HAL，实现双药物的按需释放与协同抗菌。研究目标包括：1) 成功合成并表征ODex-HAL（ODHal）复合物及ODex-AMK-HAL（ODAA）水凝胶；2) 评估水凝胶的理化性质（如凝胶时间、自愈合性、溶胀率、pH响应性药物释放）；3) 系统评价其体外和体内生物相容性及抗菌效果；4) 探索其促进伤口愈合的潜力。
详细研究流程与方法
本研究流程严谨，主要包括材料合成与表征、水凝胶制备与性能测试、体外生物相容性评价、体外抗菌评估以及体内抗菌活性验证等多个环节。
第一，关键材料的合成与表征。 研究人员首先将分子量为40 kDa的葡聚糖（Dex）用高碘酸钠氧化，在其糖环上引入醛基，得到氧化葡聚糖（ODex）。通过盐酸羟胺滴定法测得氧化度为32.80%。随后，将HAL的氨基与ODex的醛基通过希夫碱反应进行接枝，合成ODex/HAL复合物（ODHal）。通过元素分析计算，ODHal的药物负载量（Drug Loading Capacity, DLC）为21.03%，接枝率（Grafting Rate, GR）为27.93%。研究采用了核磁共振氢谱/碳谱（1H NMR/13C NMR）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、X射线衍射（XRD）和紫外-可见光谱（UV-Vis）等多种手段对Dex、ODex和ODHal进行结构表征。1H NMR显示ODex在δ 5.52–5.82处出现了半缩醛基的新峰；13C NMR在δ 175.0–185.1处发现了醛基的特征峰，而在ODHal中，δ 150.1–155.2和δ 160.0–170.1处分别出现了亚胺键和酯基的新峰。FT-IR谱图中，ODex在1728 cm⁻¹和2852 cm⁻¹处显示出醛基的伸缩振动峰，而ODHal在1636 cm⁻¹处出现了亚胺键的特征吸收峰。这些数据共同证实了ODex的成功制备以及HAL通过亚胺键成功接枝到ODex上。
第二，ODAA水凝胶及PVA/ODAA水凝胶的制备与理化性质表征。 通过简单混合ODHal溶液与抗生素AMK溶液，利用ODex剩余的醛基与AMK分子上的氨基再次形成希夫碱键进行交联，制备出ODAA水凝胶。通过改变AMK的添加量（与ODHal溶液的体积比分别为400:500, 600:500, 800:500, 1000:500），得到了四种水凝胶，分别标记为ODAA-4, -6, -8, -10。此外，为了提高水凝胶的力学强度和溶胀性能，将聚乙烯醇（Polyvinyl Alcohol, PVA）溶液与ODHal溶液混合，再与AMK交联，制备了PVA/ODAA水凝胶。 对水凝胶的性能进行了系统测试：1) 形貌结构：扫描电子显微镜（SEM）显示，所有水凝胶均具有均匀分布的多孔腔室结构，孔道相互连通，有利于氧气和营养物质交换。随着AMK浓度增加，孔结构数量增多，孔径减小，骨架更致密。2) 凝胶时间：在37°C下，ODAA-4到ODAA-10的凝胶时间从约8分钟缩短至30秒，而PVA的加入进一步影响了凝胶动力学。3) 自愈合与可注射性：将染色的与未染色的ODAA水凝胶块接触后，二者能在约30分钟内融合为一体，显示出良好的自愈合能力。同时，水凝胶前体溶液可通过注射器顺利挤出并成型，证明其具有良好的可注射性，适用于填充不规则创面。4) 溶胀性能：四种ODAA水凝胶在pH 7.4的PBS中的溶胀率在1048%到1873%之间，显示出优异的水分保持能力，有利于吸收伤口渗出液并为创面提供湿润环境。5) pH响应性：研究发现，ODAA水凝胶仅在pH 7.4的中性条件下能快速成胶，而在pH 5.0和6.0的酸性条件下无法形成稳定凝胶。将已成胶的水凝胶分别置于pH 7.4和pH 5.0的PBS中，其在酸性环境下的降解速度（7天后重量残留约30%）远快于中性环境（7天后重量残留>88%）。这归因于酸性条件下亚胺键的水解。
第三，体外药物释放研究。 为了验证水凝胶的pH响应性药物释放行为，研究分别在模拟正常组织环境（pH 7.4）和模拟炎症初期微酸性环境（pH 5.0）的PBS中测定了HAL和AMK的释放曲线。结果显示，在pH 5.0条件下，两种药物的累积释放率显著高于pH 7.4条件。例如，ODAA-6水凝胶在15天内，HAL和AMK在pH 5.0下的累积释放率分别约为62.3%和71.9%，而在pH 7.4下则低得多。这表明水凝胶能响应创伤部位的酸性微环境，实现药物的“按需”释放。此外，随着AMK浓度增加（从ODAA-4到ODAA-10），药物释放速率变慢，说明通过调节交联剂（AMK）浓度可以调控药物的释放动力学。PVA/ODAA水凝胶表现出更优的缓释性能，这得益于PVA与ODex之间形成的氢键进一步稳定了凝胶网络。
第四，生物相容性评价。 1) 溶血实验：根据国际标准，溶血率低于5%的材料可用于临床应用。实验测得ODAA水凝胶和PVA/ODAA水凝胶的溶血率分别为1.5%和2.9%，表明其具有良好的血液相容性。2) 体外细胞毒性：采用CCK-8法检测了材料对小鼠成纤维细胞（L929）的毒性。在无光照条件下，ODHal、ODAA水凝胶和PVA/ODAA水凝胶的细胞存活率均高于83%，符合生物材料安全性要求。相比之下，游离的AMK和HAL显示出一定的细胞毒性，HAL在光照1小时后细胞存活率降至约30%。这表明将药物负载于水凝胶中能有效降低其直接暴露带来的毒性。3) 体内长期毒性：将ODAA水凝胶皮下注射至小鼠背部，14天后进行血液学检查。结果显示，白细胞、淋巴细胞、红细胞、血小板等各项指标均在正常参考范围内，且与生理盐水对照组无统计学差异，证明该水凝胶无明显的长期全身毒性。
第五，体外抗菌性能评估。 研究选取了具有代表性的革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌，*S. aureus*）和革兰氏阴性菌（大肠杆菌，*E. coli*；铜绿假单胞菌，*P. aeruginosa*）来评估水凝胶的广谱抗菌效果。采用平板计数法测定细菌存活率。关键发现如下：1) 单药与双药效果对比：游离AMK对革兰氏阴性菌效果好，但对*S. aureus*效果差；游离HAL则对*S. aureus*效果好，对革兰氏阴性菌效果较弱。而ODAA水凝胶对三种细菌均表现出极强的杀灭作用，细菌存活率基本低于2%，证明了AMK与HAL的协同抗菌效应。2) 最佳配比：ODAA-6水凝胶的抗菌性能优于其他比例，被认为是药物负载与释放动力学的最佳平衡点。3) 光照射时间的影响：随着635 nm红光照射时间的延长（0, 20, 40, 60分钟），ODAA-6对*S. aureus*的抗菌效果逐渐增强，证实了光动力疗法的作用：光照时间越长，HAL产生的ROS越多，抗菌效果越强。4) 抑菌圈实验：PVA/ODAA水凝胶对三种测试菌均能产生明显的抑菌圈，直观证明了其强大的接触抗菌能力。
第六，体内抗菌活性与伤口愈合评估。 建立了小鼠背部皮下细菌感染模型和皮肤创伤感染模型。1) 皮下注射治疗：将混合菌液（S. aureus 和 *P. aeruginosa*）注射至小鼠皮下，然后分别注射生理盐水（对照组）、ODex、ODHal、ODex/AMK和ODAA水凝胶，并每日给予1小时红光照射。结果显示，ODAA治疗组（组e）的小鼠背部感染在3天内完全消退，无任何病变迹象，而其他各组均存在不同程度的感染和溃疡。对感染部位皮肤组织进行革兰染色和菌落计数发现，ODAA组组织切片中几乎看不到菌斑，且单位皮肤组织中的菌落数比生理盐水对照组降低了4个数量级，细菌存活率仅约0.3%，显著优于任何单药治疗组。2) 创伤敷料治疗：在小鼠背部制造全层皮肤缺损并接种混合细菌，然后分别应用生理盐水和PVA/ODAA水凝胶。3天后，生理盐水组伤口出现严重感染和脓疱，而PVA/ODAA水凝胶治疗组伤口愈合良好，逐渐结痂，无明显感染迹象。这些体内实验强有力地证明了ODAA水凝胶在复杂生理环境下卓越的协同抗菌能力和促进感染伤口愈合的潜力。
主要研究结果与结论
本研究成功设计并制备了一种基于氧化葡聚糖的pH响应型智能抗菌水凝胶（ODAA及PVA/ODAA）。该水凝胶具有均匀的多孔结构、适宜且可调的凝胶时间、良好的自愈合性与可注射性、高溶胀率以及关键的pH响应性药物释放特性。体外和体内实验系统证实：1) 水凝胶能将HAL的降解过快问题转化为缓释优势，并实现双药物在感染酸性微环境下的靶向释放。2) 负载的抗生素AMK与光敏剂HAL通过不同的作用机制（AMK抑制细菌蛋白质合成，HAL在光照下产生ROS破坏细菌结构）产生了显著的协同抗菌效应，对革兰氏阳性菌和阴性菌均具有广谱高效的杀灭作用。3) 水凝胶基体（ODex及PVA）赋予了材料优异的生物相容性和低细胞毒性，有效降低了游离药物的毒副作用。4) 体内感染模型证明，该水凝胶能快速清除细菌，有效控制感染，并促进创伤愈合。
研究的价值与亮点
本研究的科学价值在于巧妙地将创伤微环境pH信号作为触发器，构建了一种“智能”药物递送系统。通过希夫碱键这一动态共价键，将两种作用机制互补的药物整合于同一水凝胶网络，实现了按需、协同的药物释放，为克服细菌耐药性和提高感染治疗效果提供了新思路。在应用价值上，该水凝胶兼具可注射、自愈合、保湿、缓释、协同抗菌等多种功能，是一种极具潜力的新型创伤敷料候选材料。
研究的亮点突出体现在：1) 协同策略的创新性：将传统抗生素与光动力疗法结合，通过化学键合方式实现共递送与协同增效，覆盖了更广的抗菌谱。2) 材料设计的智能化：充分利用了感染部位与正常组织的pH差异，实现了药物的病灶部位靶向释放，提高了治疗效率并可能降低全身副作用。3) 系统全面的评价体系：从材料合成、理化表征到体外细胞毒性、抗菌测试，再到体内复杂的感染模型验证，研究流程完整，数据详实，结论可靠。4) 功能集成化：最终获得的水凝胶不是单一功能的材料，而是集药物递送、环境响应、力学适配（可注射自愈合）、湿润愈合环境营造于一体的多功能平台。
其他有价值的内容
研究中还探索了PVA的掺杂对水凝胶性能的改进。PVA的加入不仅提高了水凝胶的力学强度，使其更易于作为敷料使用，而且通过形成额外的氢键网络，进一步延缓了药物释放，获得了更优的缓释性能。这表明，通过简单的材料复合可以对水凝胶的性能进行进一步优化和定制，以满足不同的临床需求。此外，研究中对药物释放和抗菌效果的量化方法（如采用旋光法测定AMK浓度、系统研究光照时间对PDT效果的影响）也体现了研究的严谨性和深度。