本文发表于 *Bioscience Reports*（2007年，第27卷，第11–21页），作者为 Giancarlo Solaini、Gianluca Sgarbi、Giorgio Lenaz 和 Alessandra Baracca，均来自意大利博洛尼亚大学生物化学系。该文是一篇方法学综述，系统介绍了利用荧光探针评估细胞线粒体跨膜电位（mitochondrial transmembrane potential，ΔΨm）的主要技术手段、原理、优缺点及实际应用注意事项，并结合作者团队自身在人类线粒体疾病研究中的经验，重点讨论了罗丹明123（rhodamine 123，Rh-123）在稳态和动态条件下的应用策略。

文章首先阐述了线粒体在真核需氧细胞中的核心地位：它不仅是ATP的主要生产者，还参与离子稳态、细胞氧化还原状态调节、代谢物运输、脂质与氨基酸代谢以及细胞死亡等重要生理和病理过程。这些功能高度依赖于线粒体内膜两侧的电化学跨膜电位，即质子动力势（proton motive force，Δp），由跨膜电位差（ΔΨ）和质子梯度（ΔpH）两个组分构成。由于ΔΨ是Δp的主要组成部分，且在多数实验中可通过尼日利亚菌素（nigericin）等电中性K⁺/H⁺离子载体进一步消除pH组分的影响，因此大量研究聚焦于ΔΨ的监测。荧光亲脂性阳离子探针能够在线粒体膜电位的驱动下进入线粒体基质并发生积累，从而实现对ΔΨ的快速、简便检测。然而，作者明确指出，该方法虽然看似容易建立，但数据解读并不直观，甚至容易产生误导。研究者必须掌握荧光发射、淬灭（quenching）和量子产率（quantum yield）等基本概念，严格控制探针浓度以避免干扰线粒体功能，同时还需注意细胞内是否存在能够干扰探针荧光动力学或量子产率的分子或蛋白质。此外，实验过程中细胞质膜电位可能发生变化，这也是完整细胞实验中需要考量的复杂因素。

在探针选择方面，文章列举了数类常用的ΔΨ荧光染料，包括罗丹明类（如Rh-123、TMRM、TMRE）、碳菁类（如JC-1和DiOC₆(3)）、部花青类（merocyanines）和氧杂菁类（oxonols）等。这些阳离子染料因电荷性质及在膜脂相和基质水相中的溶解性，能够在电场作用下电泳式地分布到线粒体基质中。经过适当校准后，可利用其光谱特性或同位素标记法估算ΔΨ的绝对值；若不进行校准，则可通过光信号变化定性监测ΔΨ对外界化学或物理扰动的响应。作者特别指出，完整细胞与分离线粒体或去垢剂透化细胞中的荧光测量存在本质差异：在完整细胞中，探针被细胞摄取并进入线粒体后表现为荧光增强；而在分离细胞器中，由于介质中仍存在未摄取的探针，电位依赖性摄取反而引起荧光淬灭，其原因可能与染料积累后的聚集或堆叠有关。

文章随后详细比较了荧光显微镜与激光扫描共聚焦显微镜（laser-scanning confocal fluorescence microscopy）在ΔΨ检测中的应用。这些成像技术能够提供细胞内线粒体的直观图像，甚至可观察单个线粒体的分布、网络结构及膜电位的异质性，还可用于研究分子共定位现象。然而，高分辨率也带来了视野受限的问题，难以在细胞群体水平获得可靠的ΔΨ平均值。更为关键的是，显微镜方法难以进行定量校准，因为在完整细胞中几乎不可能在基质与胞质之间建立明确的离子浓度差。此外，光学显微镜的空间分辨率受衍射极限限制，而共聚焦显微镜虽可通过空间滤波消除焦外光干扰、获得光学切片，但活细胞成像仍面临诸多技术挑战，如标本制备伪影、光漂白、内滤效应以及激光系统配置等。作者还提醒，激发光本身可能直接损伤生物系统或产生大量自由基，因此必须快速获取功能性线粒体的图像。共聚焦显微镜的另一局限是只能用于完整细胞，难以研究高能量需求状态（如state 3呼吸）下的线粒体功能。尽管理论上可通过将线粒体与邻近无线粒体胞质的荧光强度比值代入能斯特方程（Nernst equation）来推算ΔΨ，但实际上共聚焦分辨率不足以单独成像线粒体基质。文章展示了利用TMRM标记的透化成纤维细胞和JC-1标记的完整淋巴细胞在对照与携带线粒体DNA 8993T>G突变患者中的成像结果，表明突变细胞在ADP磷酸化状态下ΔΨ略高于对照，而在完全解偶联或ATP合酶抑制状态下二者无显著差异。

在流式细胞术（flow cytometry）部分，作者指出该技术可估算培养基中悬浮细胞的胞内荧光，并评估群体内单个细胞ΔΨ的异质性，适用于两个细胞群体间的比较。然而，该方法要求细胞处于悬浮状态，常需刮取或胰蛋白酶消化，这可能诱导氧化应激并影响膜结构与功能。此外，流式细胞仪常在室温而非37°C下运行，可能因细胞和探针不同而产生数据波动。尽管如此，Plasek等人（2005）开发的方法已能利用TMRM在透化的人皮肤成纤维细胞中监测线粒体去极化，并以毫伏为单位评估不同细胞群体的ΔΨ差异；Lecoeur等人（2004）则报道了利用实时流式细胞术分析分离线粒体膜电位及其在外源效应物作用下的变化，这为在大量单个线粒体水平评价化合物效应提供了前景。文章中展示了利用JC-1比率荧光对完整淋巴细胞进行流式分析的结果，显示携带8993T>G突变的患者淋巴细胞FL525/FL575比值显著低于对照，提示其ΔΨ升高。

在荧光光谱法（fluorescence spectroscopy）部分，作者强调该方法虽然不能提供单细胞或亚细胞水平的异质性信息，但能给出大群体细胞的平均ΔΨ及其变化的定量信息，且可用于透化细胞在state 3和state 4呼吸状态下的分析。ΔΨ监测可分为“淬灭模式”（quench mode）和“非淬灭模式”（non-quench mode）。非淬灭模式灵敏度高，可检测数毫伏的生理性去极化，但易因淬灭阈值或探针与内源性物质结合而产生伪影。因此，淬灭模式应用更广，尤其是在监测ΔΨ的微小变化时具有较好的可靠性。罗丹明类探针因可用酯衍生物（TMRM或TMRE）快速负载细胞、对细胞环境敏感性较低且荧光量子产率高，可在极低浓度下使用，从而减少对酶活性、膜结构及线粒体渗透压的影响。作者团队在研究中发现，基于Rh-123稳态荧光的传统淬灭模式在样本量有限时重复性不佳，因此建立了一种基于Rh-123荧光淬灭动力学（kinetics）的方法，仅需70 μg蛋白质即可获得良好的可重复性。该方法通过分析荧光淬灭速率来比较不同样本中底物或效应物诱导的ΔΨ变化。文中展示了在透化的人淋巴细胞中，加入琥珀酸和ADP诱导state 3呼吸后Rh-123荧光淬灭，随后加入寡霉素诱导state 4呼吸，最后加入抗霉素A使ΔΨ消散的典型动力学曲线；同时比较了携带8993T>G突变的淋巴细胞与对照细胞在寡霉素存在与否条件下的荧光淬灭动力学。作者认为，稳态法和动力学法互为补充：样本量充足且需在同一份样本上检测多个效应物时优先选择稳态法；样本量稀缺或只需比较单一效应物诱导的ΔΨ变化时则选用动力学法。最后，作者提醒，罗丹明类探针虽易被功能性线粒体摄取，但一旦ΔΨ短暂丧失，探针可能被洗出细胞，因此涉及影响线粒体内膜通透性的实验需格外谨慎。

在结论部分，作者总结了目前评估线粒体膜电位最常用的方法和荧光探针，强调无论采用何种方法，研究者都必须深入理解其工作原理、可能的干扰因素及定量局限。成像技术的引入为线粒体膜电位研究带来了重大进展，但现有技术的局限性同样值得警惕。该综述为从事线粒体生物能量学、细胞病理学及相关领域的研究人员提供了实用的方法学参考，尤其在病理细胞研究中如何避免内源或外源物质造成的伪影方面具有重要指导意义。