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哥伦比亚家犬中新发现犬瘟热病毒谱系的系统发育证据

作者及机构
本研究由Maria A. Espinal（哥伦比亚安蒂奥基亚大学农业科学学院Centauro研究组）、Francisco J. Díaz（安蒂奥基亚大学医学院免疫病毒学组）和Julian Ruiz-Saenz（哥伦比亚合作大学兽医与动物科学学院GRICA研究组）共同完成，发表于*Veterinary Microbiology*期刊，接受日期为2014年5月15日。

学术背景
犬瘟热病毒（Canine Distemper Virus, CDV）是副黏病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒属（Morbillivirus）成员，可感染食肉目动物，对濒危物种保护构成威胁。其血凝素蛋白（Hemagglutinin, H）基因因高变异性被用于区分病毒谱系，目前全球已鉴定10个地理谱系，包括疫苗相关的America 1谱系。南美洲此前已知两个谱系：Europe/South America 1（巴西、乌拉圭流行）和South America 2（阿根廷特有）。然而，哥伦比亚等北南美国家的CDV遗传多样性尚未明确。本研究旨在通过分析哥伦比亚阿布拉谷（Aburrá Valley）家犬中CDV毒株的H基因全长序列，揭示其系统发育地位。

研究流程
1. 样本采集与处理
- 样本来源：2011年10月至2012年7月，从哥伦比亚安蒂奥基亚省多家兽医医院收集46份疑似CDV感染犬的临床样本（血清和眼分泌物）。
- 数据记录：记录犬只年龄、性别、品种、疫苗接种史及临床症状。
- 对照设置：使用4种商业疫苗（Novibac Puppy DP、Canigen MHA2 Puppy等）作为RT-PCR阳性对照。

1. 分子生物学实验

   • RNA提取：使用QIAamp Viral RNA Mini Kit提取总RNA，经Nanodrop定量后保存于-80°C。
     
   • cDNA合成：采用RevertAid Premium First Strand cDNA Synthesis Kit，以随机六聚体为引物，在Veriti DX热循环仪中完成逆转录。
     
   • PCR扩增：
     
     • 初筛：使用通用引物扩增磷酸蛋白（P）基因429 bp片段，23份样本（50%）呈阳性。
       
     • H基因全长扩增：对P基因阳性样本，用引物cdvff1/hs2扩增2100 bp片段（覆盖H基因及侧翼区域），15份样本成功测序。
       
   • 测序：由Macrogen公司完成，使用ABI3711测序仪，共8条测序引物覆盖全长。
     

2. 生物信息学分析

   • 序列比对：使用MEGA 5的MUSCLE算法对15株哥伦比亚毒株与62株全球参考毒株（含疫苗株）的H基因核苷酸及氨基酸序列进行比对。
     
   • 系统发育分析：
     
     • 模型选择：jModelTest确定最佳核苷酸替代模型为TVM+G。
       
     • 建树方法：邻接法（Neighbor-Joining）、最大似然法（PhyML 3.0）和贝叶斯推断（MrBayes 3.2.2），以America 1谱系为外类群。
       
   • 氨基酸变异分析：预测N-糖基化位点（NetGlyc 1.0），比对关键功能位点。
     

主要结果
1. 遗传特征
- 哥伦比亚毒株H基因核苷酸相似度为97.7-99.9%，与疫苗株（America 1谱系）相似度仅91.3-91.8%。
- 独特氨基酸变异：T213A、N261S、F353L等，其中I522T（除14-CO/12和39-CO/12外）可能影响病毒与上皮细胞受体（nectin-4）结合。

1. 系统发育地位

   • 所有哥伦比亚毒株形成独立单系群，与已知谱系（如Europe/South America 1、South America 2）的氨基酸差异>4%，符合新谱系定义标准。
     
   • 贝叶斯后验概率为1.0，最大似然自举值100%，支持命名为“South America 3”谱系。
     

2. 临床关联性

   • 60.9%阳性犬为1-6月龄幼犬，34.78%表现为神经与呼吸系统双重症状。
     
   • 4例接种疫苗后仍感染的犬中，26-CO/12毒株（GenBank KF835416）与疫苗株无亲缘关系，推测因免疫程序不当导致。
     

结论与价值
1. 科学意义
- 首次证实南美洲存在第三个CDV谱系（South America 3），扩展了对该病毒地理分布多样性的认知。
- 哥伦比亚毒株与疫苗株的显著差异提示需评估现有疫苗的交叉保护效力。

1. 应用价值
   
   • 为哥伦比亚及邻国（委内瑞拉、圭亚那）的CDV防控提供分子流行病学依据。
     
   • 强调需监测野生动物宿主（如浣熊、狐狸）中的病毒传播动态。
     

研究亮点
1. 方法创新：结合全长H基因测序与多算法系统发育分析，提高谱系鉴定的准确性。
2. 发现新颖性：South America 3谱系的提出填补了北南美CDV研究的空白。
3. 临床启示：揭示了疫苗接种失败的可能机制（如免疫程序缺陷），为改进免疫策略提供数据支持。

其他发现
- 疫苗D株与Rockborn疫苗株99%相似，但哥伦比亚野毒株不属于Rockborn-like谱系，排除了疫苗衍生毒株传播的可能性。
- 毒株39-CO/12（来自距麦德林22 km的收容所）的氨基酸变异（>1.8%）提示区域性遗传多样性存在。

该研究通过严谨的实验设计与多层次分析，为CDV的进化与防控提供了关键科学证据。