一项利用低场核磁共振（LF-NMR）在线监测温敏性壳聚糖/β-甘油磷酸钠水凝胶溶胶-凝胶转变温度的研究

主要作者及发表信息

本研究由中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室的Fangyu Chen、Chao Chen、Dawei Zhao、Songping Zhang、Guanghui Ma、Zhiguo Su和Xiunan Li，以及中国科学院大学化学工程学院的Fangyu Chen共同完成。其中，Zhiguo Su和Xiunan Li为共同通讯作者。该研究成果于2020年3月20日在线发表于国际学术期刊《Carbohydrate Polymers》第238卷，论文编号为116196。

学术背景与研究目的

智能水凝胶是一类能够对外界环境刺激（如温度、pH值、光等）作出物理或化学响应的软物质材料，在药物缓释、组织工程、生物分离等领域具有广泛应用。在众多环境刺激因素中，温度因其易于施加和精确调控的特点，成为引发水凝胶相转变的理想选择。温敏性壳聚糖/β-甘油磷酸钠（CS/GP）水凝胶体系因其制备方法简单、生物相容性优异以及灵敏的温度响应性，自2000年被报道以来，一直是药物递送系统和骨组织工程等领域的研究热点。准确测定该体系的溶胶-凝胶转变温度，并深入理解其相转变机理，对于设计性能更优的温敏材料至关重要。然而，传统的检测方法存在诸多局限。例如，倒置试管法结果模糊且不精确；差示扫描量热法由于物理交联水凝胶的热效应微弱，难以准确测定；流变学方法在测试过程中转子的旋转剪切力可能破坏凝胶的内部微观结构，导致结果偏差。这些方法通常是有损的，无法在保持样品原始状态下实现原位、实时监测。因此，本研究旨在开发一种基于低场核磁共振（LF-NMR，Low Field Nuclear Magnetic Resonance）技术的在线、无损、高精度方法，以实时测定CS/GP水凝胶的溶胶-凝胶转变温度，并系统研究其相转变行为。

研究流程与实验方法

本研究的实验流程主要包括五个部分：温敏性壳聚糖水凝胶的制备、流变学性能表征、低场核磁共振在线温度控制测量、溶胶-凝胶相转变的精细测定以及热稳定性分析。

第一步，研究者制备了具有不同β-甘油磷酸钠浓度的CS/GP水凝胶。他们将壳聚糖溶解于0.1 mol/L的盐酸溶液中，配制成2%（w/v）的浓度；同时将β-甘油磷酸钠溶于去离子水中，配制成50%（w/v）的溶液，并在4°C下冷藏备用。在持续搅拌和4°C低温条件下，将GP溶液逐滴加入CS溶液中，制备出CS终浓度为1.5%，GP浓度分别为7%、8%、9%、10%和11%（w/v）的五组样品，总容量为10毫升。所有制备好的水凝胶样品均在4°C去离子水中保存待测。

第二步，研究者使用马尔文Bohlin Gemini 2流变仪对五种浓度的CS/GP溶液进行了温度扫描测试。实验中采用直径40毫米的平行板夹具，样品厚度为1毫米，测试频率设定为1赫兹。为防止水分蒸发，测量在饱和湿度条件下进行。温度以1°C/分钟的变化速率从25°C升至40°C，同步记录样品的弹性模量和粘性模量随温度的变化。每个浓度的样品均重复测量五次。该实验旨在提供凝胶化温度的参照数据，并观察凝胶网络形成过程中力学性质的变化。

第三步，研究者利用一台配备有外循环低温恒温浴的12兆赫兹低场核磁共振谱仪，建立了在线温度控制LF-NMR测量系统。仪器腔内通过校准的光纤探头精确控制并监测样品温度，温度范围为-40°C至70°C。测试时，将1毫升水凝胶样品装入2毫升的HPLC自动进样瓶中，并用特氟龙棒填充死体积以防止水分损失，随后将其置入磁体腔内。横向弛豫时间T2采用经典的Carr-Purcell-Meiboom-Gill脉冲序列进行测定，其中90°和180°脉冲宽度分别为4.60微秒和8.72微秒，回波时间为1毫秒，重复扫描8次。

第四步，研究者利用上述系统在线监测水凝胶的相转变过程。测量温度范围设定为5°C至40°C，首先以1°C/分钟的升温速率和5分钟的测量间隔进行初步扫描，将相转变温度范围缩小到30°C至40°C之间。为了精确测定相转变温度点，在该温度范围内将升温速率降低至0.2°C/分钟，测量间隔缩短为2分钟，并减少累加采样次数以提高时间分辨率。整个测量过程为非侵入性，样品无需取出，实现了对水分子运动状态的实时、连续监测。

第五步，研究者通过热重分析和差示扫描量热法对水凝胶的热稳定性和热效应进行评估。热重分析在氮气氛围下以5°C/分钟的速率从20°C加热至200°C。差示扫描量热法则使用微量热量扫描仪，以1°C/分钟的升降温和5°C至70°C的量程，精确测量了不同浓度水凝胶样品的吸热峰变化，每次加样量为500微升，每个浓度重复测试五次。

数据分析流程的核心在于分析LF-NMR测得的T2弛豫时间分布。通过多指数衰减曲线拟合与反演，得到一至三个独立的T2分布峰，分别代表处于不同状态的水分子，即结合水、束缚水和自由水。本研究通过追踪代表凝胶网络内水分子的T21峰和代表被挤出网络的自由水的T22峰的振幅、峰面积及弛豫时间随温度的变化，来确定凝胶化发生的精确温度。

主要研究结果与讨论

研究结果显示，在线温度控制LF-NMR成功监测了CS/GP水凝胶的溶胶-凝胶转变过程。

流变学实验表明，当温度升高时，不同浓度水凝胶的弹性模量（G’）和粘性模量（G’’）均缓慢增加，随后G’超过G’’，两者相交的交点温度可视为宏观凝胶化点。随着GP浓度从7%增加至11%，该交点温度从36.5°C逐渐降低至32.2°C。然而，该交点温度略低于LF-NMR测得的相转变温度，这是因为流变测试的持续剪切导致了凝胶脱水及结构破坏。

LF-NMR的结果更为精细和深入。实验发现，在30°C以下，所有样品的T2谱图中仅出现一个位于100至1000毫秒之间的峰，即T21组分，它代表了被束缚在凝胶网络内的水分子（本研究统称为“凝胶水”）。随着温度升高并进入相转变区域（约32°C至37°C），T2谱图发生显著变化。首先，T21峰的位置（即T2值）开始向左侧移动，表明水分子的运动性因被固定在逐渐形成的三维网络中而显著降低。更重要的是，在T21峰的右侧出现了一个新的T22组分，并且其峰面积随温度升高而持续增大。T22组分代表从凝胶网络中析出的、运动自由度更大的自由水。通过分析T21峰振幅随温度变化的曲线，可以观察到一个明显的拐点，该拐点即为溶胶-凝胶转变的起始温度。对于浓度为7%至11%的CS/GP水凝胶，LF-NMR测得的凝胶化温度分别为36.98°C、35.83°C、34.75°C、34.19°C和32.42°C，这一变化趋势与流变学结果一致，但精确度更高。

通过对比三种检测方法发现，DSC测得的凝胶化温度（如7%样品为43.34°C）系统性偏高，这是由于物理交联过程的热效应微弱，且其重复性较差（RSD：1.2%–3.7%）。流变学测得的温度（如7%样品为36.5°C）则系统性偏低，且重复性中等（RSD：1.1%–2.3%）。而LF-NMR方法不仅能够无损、原位地监测相转变过程，其测量结果的相对标准偏差不超过0.1%，表现出了极高的灵敏度和精确性。此外，LF-NMR还揭示了凝胶化的动力学过程：凝胶形成并非在单一温度点瞬时完成，而是一个渐进的过程，在温度达到拐点后，随着疏水作用和氢键的进一步增强，凝胶网络继续收缩并将内部水分挤出，表现为T21峰面积的持续下降和T22峰面积的持续上升。

研究结论与价值

本研究成功建立了一种在线、温度可控的低场核磁共振T2弛豫测定方法，并将其应用于壳聚糖/β-甘油磷酸钠温敏水凝胶溶胶-凝胶转变温度的实时、原位监测。研究结论证实，与传统方法相比，LF-NMR技术具有无损、快速、精确度高的显著优势，能够通过监测水分子运动性的细微变化，精确捕捉相转变的起始温度，并动态追踪伴随凝胶化的水分子迁移和微观结构演变过程。

该研究的科学价值在于，它为表征温敏性物理交联水凝胶这类热效应微弱、结构易破坏的软材料，提供了一种全新的、有力的分析工具，能够获取传统方法无法提供的关于水状态与分布的丰富信息。在应用价值层面，此方法可用于指导更高效温敏药物载体的设计，通过精确调控配方浓度来定制所需的凝胶化温度，确保其在人体生理温度附近实现可控的溶胶-凝胶转变，优化药物的包载与释放行为。

研究亮点

本研究的核心亮点在于：（1）创新性地将在线精确控温模块与LF-NMR技术结合，实现了对温敏水凝胶相转变过程的非侵入式、连续动态监测，克服了DSC和流变学等传统方法的有损性和不精确性；（2）聚焦于通过“水”这一凝胶核心组分的分子运动性变化来反演凝胶网络的微观结构演变，为研究提供了一个对样品零损伤的独特视角；（3）极高的测量精度（相对标准偏差≤0.1%）使得该方法有望成为测定此类材料相变温度的标准方法。