本研究由Federica Buonocore, Jenifer P. Suntharalingham, Olumide K. Ogunbiyi, Aragorn Jones, Nadjeda Moreno, Paola Niola, Tony Brooks, Nita Solanky, Mehul T. Dattani, Ignacio del Valle & John C. Achermann 共同完成。研究团队主要来自英国伦敦大学学院大奥蒙德街儿童健康研究所遗传与基因组医学系、组织病理学系、发育生物学与癌症系，以及纽卡斯尔大学生物科学研究所和UCL基因组学中心。该研究成果以论文《Transcriptomic sex differences in early human fetal brain development》的形式，于2025年发表在《自然》旗下的《Communications Biology》期刊上。
研究背景与目的 该研究的科学领域聚焦于人类发育生物学与神经科学，具体关注早期胎儿大脑发育中的性别差异。目前，尽管已知性别染色体和性激素对大脑发育有深远影响，但二者在人类大脑发育早期（特别是妊娠中、晚期之前）的具体作用机制仍不明确。大多数相关研究集中于产后或成年期，或依赖于动物模型，而关于人类胎儿大脑在关键发育窗口期（例如，在雄性胎儿开始分泌睾酮之后）的转录组学性别差异数据非常有限。这限制了我们理解神经发育性疾病（如自闭症谱系障碍、精神分裂症等）存在性别偏倚的潜在生物学基础。 因此，本研究的核心目标是：系统探究在人类胎儿大脑皮层发育的一个关键时期（妊娠7.5-17周），性别染色体和性激素相关基因表达的差异。这一时期涵盖了46，XY胎儿睾丸开始分泌睾酮（约妊娠8周）的关键节点。具体研究目的包括：1）确定46,XX和46,XY样本之间是否存在代表性别染色体基因影响的全局性差异，以及这种差异在大脑与其他组织中有何不同；2）识别是否存在具有强大脑特异性的差异表达基因；3）探究随着时间的推移，皮层基因转录是否存在与性别相关的 divergent patterns，这些模式是否可能代表性激素（睾酮）依赖的事件；4）探索发育中的大脑皮层或其他区域是否可能存在更局域化的性激素效应，并与生物学结局相关联。
详细研究方法与流程 本研究采用了严谨且重复验证的转录组学分析策略，其工作流程主要包含以下几个步骤： 1. 样本收集与准备： 研究使用的所有人类胚胎和胎儿大脑皮层样本均来自英国医学研究理事会和惠康信托基金资助的“人类发育生物学资源”（Human Developmental Biology Resource, HDBR）库，并获得了相应的伦理批准和知情同意。研究重点分析了大脑皮层/端脑区域。样本年龄通过 Carnegie 分期（8周前）或膝-跟长度和足长（8周后）估算，并通过G-显带或定量PCR进行核型分析以确定性别并排除重大染色体异常。 2. 构建两个独立的批量RNA测序数据集： 为了增强研究的稳健性和可重复性，研究者构建了两个独立的RNA-seq数据集，每个数据集均包含32个样本（16个46,XX和16个46,XY），覆盖四个发育时间点：Carnegie Stage 22-23（对应7.5-8周）、9周、11-12周以及15-17周。这个时间框架特意设计为跨越46，XY胎儿睾丸开始分泌睾酮（约8周）前后，以便捕捉潜在的基线差异和激素诱导的变化。 * Brain-seq 1 数据集： 研究人员从新采集的样本中提取总RNA，使用Agilent Tapestation评估RNA质量（RIN值在7.2-9.5之间）。使用Kapa mRNA HyperPrep Kit制备cDNA文库，并在Illumina NextSeq 500测序仪上进行单次运行（配对末端，43bp），以减少批次效应。 * Brain-seq 2 数据集： 作为独立验证集，研究人员从HDBR已有的胎儿大脑转录组资源中获取原始数据，并采用与Brain-seq 1完全相同的生物信息学分析流程进行处理，确保了分析标准的一致性和可比性。研究者从该资源中选择了与Brain-seq 1相匹配的发育阶段和样本数量，构成了第二个平衡的数据集。 3. 生物信息学分析与数据处理： 两个数据集的FastQ文件均使用FastQC进行质量评估，然后使用STAR比对软件将序列比对到人类参考基因组（Ensembl GRCh37）。使用Rsubread包中的featureCounts工具生成唯一比对读数的计数矩阵。MultiQC用于可视化质量控制结果。核心的差异表达分析使用DESeq2 R包完成，遵循标准方法，并应用了log2倍变化收缩函数。显著性阈值设定为校正后p值<0.05。此外，为了识别大脑特异性基因，研究者还将大脑中的差异表达基因与其他组织（肾脏、胰腺、肝脏、皮肤）中分析得到的差异表达基因进行了交叉比对。 4. 补充实验验证： * 定量逆转录PCR： 为了验证关键基因PCDH11Y的表达模式，研究者对46，XY大脑皮层样本以及四种对照组织（肾脏、肝脏、胰腺、皮肤）进行了qRT-PCR分析，使用TaqMan探针和GAPDH作为内参基因，实验独立重复两次。 * 免疫组织化学： 为了探究雄激素受体蛋白在发育大脑中的定位，研究者使用经过验证的雄激素受体特异性抗体，对10周和17周的人类胎儿大脑皮层样本进行了免疫组化染色，并使用数字病理扫描仪和QuPath软件进行分析。 * 公共数据库挖掘： 研究整合了多个公共数据资源以提供补充证据和背景信息，包括：人类蛋白质图谱共识表达数据和基因型-组织表达项目用于评估基因在成人大脑及其他组织中的表达模式；Ensembl基因组浏览器用于基因的基因组学特征和物种比较；已发表的人胎儿垂体（Zhang et al., 2020）和下丘脑（Herb et al., 2023）单细胞RNA测序数据库，用于探究AR在特定脑区及细胞类型中的表达情况。
主要研究结果 1. 早期人类大脑皮层发育中的全局性别差异： 对两个独立数据集的主成分分析表明，第一主成分主要反映了样本的发育阶段（年龄），解释了35%-42%的方差。第二主成分则与样本的核型（性别）相关，解释了19%-20%的方差，提示存在性别相关的转录差异。然而，这种由性别染色体导致的分布模式在其他发育组织（如肾脏、胰腺）中也被观察到，说明性别染色体的影响并非大脑特有，而是早期发育中多种组织的共同现象。 2. 性别染色体基因的表达差异： 全局差异表达分析发现，在46，XX样本中，有4个与X染色体失活相关的基因在两组数据集中均一致性地高表达：XIST, TSIX, JPX, ZFX。在46，XY样本中，有20个基因一致性地高表达。更详细的阶段特异性分析揭示，在所有年龄阶段的比较中，只有两个基因在46，XX样本中持续高表达，即X失活的关键调控因子XIST和TSIX。相反，有一个由18个Y染色体基因组成的“核心”组在46，XY大脑样本中持续高表达。 3. 大脑特异性性别差异基因的鉴定： 为了筛选出具有大脑特异性的基因，研究者将大脑皮层中在46，XY样本中差异表达的基因与其他组织中的差异表达基因进行交叉比对。结果表明，只有两个Y染色体基因表现出强大脑特异性：PCDH11Y和RP11-424G14.1。其中，PCDH11Y编码原钙粘蛋白11Y连锁蛋白，是钙粘蛋白家族成员，参与兴奋性神经元间的细胞通讯。qRT-PCR验证了PCDH11Y在发育中的46，XY大脑中显著高表达，且其表达水平随胎龄增加而升高，尤其在15-17周时尤为显著。公共数据库也显示PCDH11Y在成人大脑（特别是大脑皮层和下丘脑）中特异性高表达。重要的是，其位于X染色体的同源基因PCDH11X在46，XX和46，XY大脑中的表达水平相似，提示PCDH11Y对46，XY大脑可能具有独特的或叠加的效应。另一个基因RP11-424G14.1是一个功能未知的长链非编码RNA。 4. 性激素通路相关基因的表达分析： 研究检测了雄激素受体基因在大脑皮层中的表达。两个数据集均显示，AR在46，XX和46，XY组织中的表达水平非常相似，并且随着年龄增长（从CS22-23到15-17周）呈现出一致且显著的下降趋势，这与成人大脑中AR低表达的现象相符。研究者试图寻找可能由睾酮诱导的雄激素响应基因，但未能发现任何基因在两个数据集中均表现出与睾酮暴露时间点一致且特异的表达上调模式。此外，负责将睾酮转化为更强效雄激素双氢睾酮的关键酶5α-还原酶2型的编码基因SRD5A2在大脑皮层中的表达极低。与雌激素合成和作用相关的基因（CYP19A1， ESR1， ESR2）在所有皮层样本中的表达计数也极低，且未显示性别二态性差异。 5. AR的局域化表达： 尽管全局皮层分析未显示明显的性激素效应，但免疫组化揭示了AR蛋白在发育大脑中的局域化核表达，特别是在中线结构和下丘脑基底区。对已发表单细胞RNA-seq数据的挖掘进一步支持了这一发现：在人类胎儿垂体数据中，AR在促肾上腺皮质激素细胞系中表达最高；在人类胎儿下丘脑数据中，AR在弓状核区域表达最强。这表明AR的局域化表达及其作用可能随时间推移在特定脑区（如下丘脑-垂体-内分泌调节轴）变得重要。
结论与研究意义 本研究通过系统性的转录组学分析，揭示了在人类胎儿大脑发育早期（妊娠7.5-17周），存在有限但潜在重要的性别差异。主要结论如下： 1. 性别染色体效应占主导： 在此期间，大脑皮层中观察到的绝大多数一致性转录组差异是由性别染色体基因驱动的。在46，XX样本中是X失活基因，在46，XY样本中则是一个包含18个基因的Y染色体“核心”组。 2. 鉴定出大脑特异性Y染色体基因： 研究发现PCDH11Y和RP11-424G14.1是高度大脑特异性的Y染色体基因。PCDH11Y与神经元通讯和语言发育相关，是人类特有的基因，这提示其在人类特异性神经发育和功能中可能扮演独特角色。 3. 性激素的全局性皮层效应有限： 在大脑皮层整体水平上，未检测到显著的、由性激素驱动的全局性转录组变化。AR表达在两性中相似且随胎龄下降，未发现明确的雄激素响应基因，且关键性激素合成与转化酶的表达很低或缺失。 4. 局域化性激素作用的可能性： AR在特定脑区（如垂体促肾上腺皮质激素细胞、下丘脑弓状核）的局域化表达提示，性激素的作用可能更集中地体现在调控内分泌和稳态的特定神经回路中，而非广泛影响整个大脑皮层。
研究的科学价值与亮点 科学价值： * 填补知识空白： 提供了关于人类胎儿大脑在关键早期发育窗口期转录组性别差异的高质量、可重复数据，弥补了该领域研究的不足。 * 机制解析： 明确了在妊娠中期之前，大脑发育的性别差异主要由性别染色体基因（尤其是Y染色体基因）的固有表达程序所主导，而非早期睾酮的广泛组织重塑作用。 * 提供新靶点： 鉴定出PCDH11Y等大脑特异性Y染色体基因，为理解人类大脑性别二态性、语言发育以及自闭症等神经发育性疾病的性别偏倚提供了新的候选分子机制。 * 指导未来方向： 研究结果将未来探索性激素对大脑影响的研究方向，从“全局皮层效应”引导至对“特定脑区及细胞类型”的局域化作用的深入探究。
研究亮点： 1. 严谨的重复验证设计： 研究最大的方法学亮点是构建并分析了两个完全独立、但样本匹配、分析流程标准化的批量RNA-seq数据集，极大地增强了研究发现的稳健性和可靠性。 2. 聚焦关键发育窗口： 研究时间段精心设计，覆盖了性腺激素分泌起始的关键时期，能够有效区分染色体固有效应与激素诱导效应。 3. 多层次数据整合： 不仅依赖于转录组学，还结合了qRT-PCR验证、免疫组化蛋白定位分析，并整合了丰富的公共单细胞测序资源和蛋白表达数据库，构成了立体的证据链。 4. 重要发现： 明确鉴定出PCDH11Y是人类胎儿大脑发育中一个具有高度大脑特异性的Y染色体基因，并关联其与人类特有的神经功能，是本研究最具新颖性的发现之一。
其他有价值内容 研究还讨论了PCDH11Y基因的进化背景，指出它位于Y染色体的“X退化区”，在大约600万年前从X染色体同源基因演化而来，为人类所特有，在黑猩猩或大猩猩中不存在。这一进化特征，加上其可能的神经功能，使其成为研究人类语言发育和认知疾病性别差异的一个极具吸引力的候选基因。此外，研究也坦诚了其局限性，如批量RNA-seq方法缺乏单细胞分辨率、样本量可能不足以检测更细微的变化、难以对PCDH11Y进行特异性蛋白水平研究等，为未来更深入的研究指明了方向。