本文为一项原创研究（类型a），以下为研究报告。
一、研究作者、机构与发表信息
本研究由Chaoqun Liu、Xiaopeng Zhao、Anlei Yuan等作者完成，其中Chaoqun Liu与Xiaopeng Zhao为共同第一作者。通讯作者为Yanling Zhang（北京中医药大学中药学院，国家中医药管理局中医药信息工程重点实验室）和Zhaozhou Lin（北京同仁堂股份有限公司）。该研究发表于Food & Nutrition Research期刊，2025年第69卷，文章编号12763，于2025年10月23日正式发表。
二、研究背景与目的
糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病常见的微血管并发症，约20%～40%的糖尿病患者会发展为DN，是导致终末期肾病的重要原因。目前临床干预手段包括降糖、降压、降脂及抗氧化治疗等，但存在副作用和疗效不充分等问题。六味地黄丸（Liuwei Dihuang Pills，LW）是由熟地黄（rehmanniae radix praeparata，RRP）、山茱萸（cornus officinalis，CO）、牡丹皮（moutan cortex，MC）、山药（rhizoma dioscoreae，RD）、泽泻（alismatis rhizoma，AR）和茯苓（poria cocos，PC）六味中药组成的经典方剂，在DN治疗中显示出显著临床疗效，可改善DN蛋白尿并保护肾小球系膜细胞。然而，由于中药复方多成分、多靶点的特性，LW治疗DN的物质基础和作用机制尚不清晰。本研究旨在系统阐明LW抗DN的潜在机制和物质基础，为其临床应用提供依据。
三、研究流程与方法
本研究整合了网络药理学（network pharmacology）、转录组学（transcriptomics）、分子对接（molecular docking）和体外实验（in vitro experiments）四种策略，依次包括以下主要环节。
第一环节为体外胃肠模拟消化与成分鉴定。首先将LW及其六味组成药材粉末在模拟胃液（simulated gastric fluid，SGF）和模拟肠液（simulated intestinal fluid，SIF）中进行体外胃肠模拟消化。该技术可模拟人体消化过程而无需动物伦理审批。消化产物经超高效液相色谱-线性离子阱-轨道阱质谱联用（UPLC/LTQ-Orbitrap-MS）分析，在正、负离子模式下通过匹配保留时间、分子离子和碎片离子与文献数据，共鉴定出43个原型成分，包括10个环烯醚萜苷、4个三萜类、6个单萜类和4个苯乙醇苷类等。
第二环节为网络药理学分析。通过SwissADME筛选具有高胃肠吸收且满足Lipinski五规则中至少三条的成分，获得13个潜在活性成分。利用SwissTargetPrediction和Discovery Studio 4.0预测得到253个LW相关靶点；从GeneCards和DisGeNet数据库收集453个DN相关靶点。取交集后得到69个潜在治疗靶点。基于STRING数据库和Cytoscape 3.7.1构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein–protein interaction，PPI）网络，包含69个节点和645条边。GO富集分析显示，LW治疗DN主要涉及凋亡信号通路负调控、表皮生长因子受体信号通路、细胞-基质黏附调控、氧化应激细胞反应、髓系白细胞迁移及炎症反应介质产生等生物学过程。
第三环节为体外药效验证。以人肾小球内皮细胞（human renal glomerular endothelial cells，HRGEC）和HK2细胞（人肾小管上皮细胞）为研究对象。采用300 μM叔丁基过氧化氢（tert-butyl hydroperoxide，t-BHP）诱导HRGEC氧化损伤模型，采用5 ng/mL转化生长因子β1（transforming growth factor，TGF-β1）诱导HK2细胞纤维化模型。CCK-8实验检测细胞活力；实时定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）检测纤维化标志物E-cadherin（E-cad）、纤连蛋白（fibronectin，FN）和波形蛋白（vimentin，VIM）及关键靶点的mRNA表达。
第四环节为转录组学分析。对HRGEC氧化损伤模型和HK2纤维化模型进行RNA测序。差异表达分析使用DESeq2 R包，以|log2FC|>1且p<0.05为筛选标准。对LW回调差异表达基因（callback-DEGs）进行GSEA（gene set enrichment analysis）和KEGG富集分析，取两者共同通路为关键通路，其核心富集列表中的回调DEGs为关键靶点。
第五环节为分子对接筛选活性成分。利用Discovery Studio 4.0的CDOCKER模块，将13个潜在活性成分与关键靶点VEGFA（PDB ID：1BJ1）、EGR1（PDB ID：4X9J）和BMP4（AlphaFold结构）进行分子对接，以-CDCoker能量和-CDCoker相互作用能量均大于0为标准筛选关键成分。
四、主要研究结果
在HRGEC氧化损伤模型中，LW（1–10 mg/mL）可有效抑制t-BHP诱导的氧化应激损伤。在HK2纤维化模型中，LW显著上调E-cad mRNA表达，下调FN和VIM mRNA表达，表明LW能改善肾小管上皮细胞纤维化。对六味组成药材的评估显示，CO（0.625–1.25 mg/mL）、MC（1.25–5 mg/mL）、RD（5–10 mg/mL）和AR（2.5–10 mg/mL）可显著保护HRGEC免受氧化损伤，而RRP和PC无此保护作用；在抗纤维化方面，除AR外，RRP、CO、MC、RD和PC（各2.5、2.5、2.5、5、1.25 mg/mL）均能显著改善HK2细胞纤维化。
转录组分析方面，在HRGEC模型中，模型组与对照组比较筛选出1184个DEGs（775个上调，409个下调），LW组与模型组比较筛选出414个DEGs（132个上调，282个下调），其中192个为回调DEGs。GSEA与KEGG共同富集得到26条通路，其中“糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路”与微血管氧化损伤密切相关。VEGFA（vascular endothelial growth factor A）和EGR1（early growth response 1）被确定为该通路中的关键回调DEGs。RT-qPCR验证显示，LW显著下调HRGEC中VEGFA和EGR1的mRNA表达，提示LW通过下调VEGFA和EGR1抑制AGE-RAGE信号通路，改善肾小球微血管内皮损伤。
在HK2纤维化模型中，模型组与对照组比较获得1661个DEGs（699个上调，962个下调），LW组与模型组比较获得2574个DEGs（1126个上调，1448个下调），其中996个为回调DEGs。GSEA与KEGG共同富集得到22条通路，其中TGF-β信号通路与肾纤维化密切相关。BMP4（bone morphogenetic protein 4）被确定为该通路的关键回调DEGs。RT-qPCR验证显示，LW显著上调HK2细胞中BMP4的mRNA表达，说明LW通过上调BMP4抑制TGF-β信号通路，发挥抗肾纤维化作用。
分子对接结果显示，与VEGFA结合活性良好的成分有5个，包括紫杉叶素（taxifolin）、花青素（cianidanol）、没食子酸（gallic acid）、咖啡酸（caffeic acid）、5-羟甲基糠醛（5-hydroxymethylfurfural）和丹皮酚（paeonol）；与EGR1有良好结合亲和力的有5个成分，包括咖啡酸等；与BMP4有良好结合的有6个成分，包括花青素和没食子酸等。综合而言，紫杉叶素、花青素、没食子酸、咖啡酸、5-羟甲基糠醛和丹皮酚是LW改善微血管内皮损伤和肾纤维化的关键物质基础。其中紫杉叶素主要来源于RD，丹皮酚和花青素主要来源于MC，5-羟甲基糠醛主要来源于RRP，没食子酸和咖啡酸来源于RRP和CO等多种药材。
五、研究结论与价值
本研究系统揭示了LW抗DN的机制与物质基础：LW通过紫杉叶素、花青素、没食子酸、咖啡酸、5-羟甲基糠醛和丹皮酚等成分，靶向VEGFA、EGR1和BMP4，分别调控糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路和TGF-β信号通路，从而改善肾小球微血管损伤和肾纤维化。该研究从分子水平阐明了LW多成分、多靶点、多通路治疗DN的科学内涵，为LW的临床合理应用提供了理论依据。
六、研究亮点
本研究的创新性在于：其一，采用体外胃肠模拟消化结合UPLC/LTQ-Orbitrap-MS技术鉴定LW的体内可吸收原型成分，更贴近药物实际起效的物质形式；其二，整合网络药理学预测、转录组学验证、分子对接筛选和体外实验确证的多层次研究策略，实现了从“成分-靶点-通路-功能”的系统性论证；其三，分别针对DN的两个标志性病理特征——肾小球微血管内皮损伤和肾纤维化——建立了相应的细胞模型并进行机制解析，明确区分了LW在不同病理环节的作用靶点和活性成分来源；其四，通过共同通路分析将GSEA和KEGG结果交叉验证，提高了关键通路和靶点的可靠性。
七、局限性与展望
作者也指出本研究存在一定局限性：体外模型无法完全模拟人类DN的复杂病理生理过程；分子对接未能识别出PC和AR中的活性成分，可能与ADMET预测算法局限或存在未表征的代谢产物有关；研究聚焦于单一靶点和通路，未评估LW各成分间的协同作用。未来应在此基础上开展更多体内外实验，结合代谢组学或活性导向分离等先进技术，并通过组合药理学研究进一步阐明LW抗DN的协同机制。