本研究由emerson de castro barbosa、tânia maria almeida alves、carlos leomar zani及jaquelline germano de oliveira等学者共同完成，主要依托巴西奥斯瓦尔多·克鲁兹基金会（Fundação Oswaldo Cruz）下辖的rené rachou研究所（Instituto René Rachou - Fiocruz Minas），并联合了巴西圣若昂德尔雷联邦大学（Universidade Federal de São João del-Rei）和米纳斯吉拉斯联邦大学（Universidade Federal de Minas Gerais）的研究人员。该论文发表于《Virology Journal》（2022年19卷，文章编号31），属于单篇原始研究论文，旨在从植物提取物中筛选并鉴定具有抗登革病毒（DENV）和寨卡病毒（ZIKV）活性的天然化合物。

登革热和寨卡热在全球范围内构成重大公共卫生威胁，二者均由黄病毒科（Flaviviridae）虫媒病毒引起。目前尚无针对寨卡病毒的特效抗病毒药物获批；登革热虽有疫苗，但其适用范围受血清型、血清状态和年龄限制，临床治疗仍以缓解症状为主。因此，寻找新的抗病毒药物迫在眉睫。植物来源的天然产物历来是药物开发的重要资源，尤其是生物碱类化合物在抗病毒研究中显示出巨大潜力。本研究的核心目标包括：（1）筛选巴西不同生物群落植物提取物的抗登革病毒2型（DENV-2）和寨卡病毒（ZIKV）活性；（2）通过生物活性导向分离纯化活性化合物；（3）评估纯化合物对DENV-2和ZIKV的抗病毒效力及其细胞毒性。

研究采用了系统的体外实验流程。首先，研究团队基于细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）减少和3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）比色法建立并验证了抗病毒高通量筛选体系。该方法的验证遵循美国国立卫生研究院（NIH）的测定指南，通过设置高、中、低信号对照评估了板内变异、边缘效应和Z’因子等质量参数。筛选阶段共检测了约7000份植物粗提物对DENV-2的活性，其中1000份同时用于ZIKV测试。筛选在非洲绿猴肾细胞（Vero）和幼仓鼠肾细胞（BHK-21）中进行，病毒感染复数（multiplicity of infection，M.O.I.）为2，提取物初筛浓度为50 μg/mL。通过观察CPE减少程度和MTT法测定细胞活力，以至少50%的保护率为活性判定标准。随后，对初筛阳性提取物进行了半数有效浓度（EC50）和半数细胞毒性浓度（CC50）的剂量依赖实验，并计算选择性指数（selectivity index，SI=CC50/EC50）。此外，研究还通过空斑减少实验评估了活性提取物的直接杀病毒活性，即将提取物与病毒悬液在37°C预孵育60分钟后，通过空斑形成单位计数判断其是否能中和病毒颗粒。

在获得活性提取物后，研究团队利用超高效液相色谱-高分辨质谱联用技术（UHPLC-HRMS/MS）进行生物活性导向分级分离。该技术将色谱分离与高分辨电喷雾四极杆飞行时间质谱（ESI-QTOF-MS）相结合，通过一级质谱的精确质量数和同位素模式确定分子式，并通过二级质谱碎片谱图与内部数据库、MassBank公共数据库以及通用天然产物数据库（UNPD-ISDB）的计算机模拟碎片谱图比对，对化合物进行初步鉴定。随后，利用柱后收集系统将色谱流出物收集到96孔板中，干燥后分别进行抗病毒活性测试。对具有活性的级分，通过保留时间、精确质荷比和MS/MS碎片特征跟踪目标化合物，并结合制备色谱进行分离纯化。最终化合物的结构通过核磁共振波谱（NMR）确认。针对某些难以获取的化合物，研究还合成了石蒜碱（lycorine）的单乙酰化和双乙酰化衍生物。为了评估石蒜碱与网球花胺（pretazettine）联合用药的潜在协同效应，研究组采用固定比例等辐射线法（isobologram method）进行了相互作用分析，并计算分数抑制浓度指数（FICI）。此外，利用pkCSM平台对纯化合物的吸收、分布、代谢、排泄和毒性（ADMET）性质进行了计算机预测。

研究结果显示，共有来自15个植物物种的21份提取物表现出对DENV-2和/或ZIKV的体外抗病毒活性。其中，石蒜科（Amaryllidaceae）的Hippeastrum属最为突出，贡献了7份活性提取物。12份提取物对DENV-2的EC50小于10 μg/mL，4份对ZIKV的EC50小于10 μg/mL。13份提取物在空斑减少实验中显示出直接杀病毒作用，即在非细胞毒性浓度下可使空斑数减少至少90%。通过生物活性导向分离，从活性级分中鉴定出16种已知生物碱和1种黄酮类化合物。其中，石蒜碱、网球花胺、水仙环素（narciclasine）和水仙环素-4-O-β-D-木吡喃糖苷（narciclasine-4-O-β-D-xylopyranoside，NXP）被成功纯化并进行了详细活性评价。石蒜碱对DENV-2和ZIKV的EC50分别为0.5 μM和0.9 μM，SI分别为8.6和3.8。网球花胺对DENV-2和ZIKV的EC50分别为0.8 μM和1.9 μM，SI分别为6.8和3.8。水仙环素活性最强，对两种病毒的EC50均为0.02 μM，但其细胞毒性也最强，CC50在0.09–0.12 μM之间，SI分别为4.5和6.0。NXP的活性较弱（EC50=7.9 μM），但细胞毒性显著降低（CC50为39.3–51.8 μM），SI维持在4.9–6.5。芦丁（rutine）未显示抗病毒活性。石蒜碱的1-乙酰化和1,2-二乙酰化衍生物对DENV-2均无活性，1-乙酰化石蒜碱对ZIKV活性极弱（EC50=19.3 μM，SI=1.0），而1,2-二乙酰化石蒜碱则完全丧失活性且细胞毒性极低（CC50>100 μM）。石蒜碱与网球花胺的联合用药实验显示，两者在抗DENV-2和ZIKV活性以及对BHK-21和Vero细胞的毒性方面均表现为相加或无关效应，FICI范围为0.87–1.17，未观察到协同或拮抗作用。ADMET预测表明，这四种化合物可能具有良好的代谢特征且均无致突变性；其中石蒜碱和网球花胺在口服吸收、分布和排泄参数上表现出作为候选药物进入动物模型研究的潜力。

本研究的结论强调了植物提取物，尤其是Hippeastrum属植物，作为抗ZIKV和DENV-2天然产物来源的重要价值。研究首次报道了网球花胺、水仙环素和NXP对寨卡病毒的抗病毒活性，并证实水仙环素在极低浓度下即可抑制DENV-2和ZIKV复制。尽管水仙环素的治疗窗口较窄，但其糖苷NXP在保持一定抗病毒活性的同时大幅降低了细胞毒性，为后续结构优化提供了重要线索。石蒜碱和网球花胺具有较好的选择性指数和预测药代动力学特性，可作为体内研究候选分子。本研究不仅从大规模植物提取物筛选中发现了多个抗黄病毒活性化合物，还建立了一套将高通量筛选、生物活性导向分离、质谱追踪和计算机辅助ADMET预测相结合的天然产物抗病毒药物发现流程。该工作为今后探索Hippeastrum及其他石蒜科植物中尚未检测的生物碱类成分的抗病毒潜力奠定了基础，并强调了天然产物化学多样性在应对新兴病毒性疾病中的现实意义。