骨科植入物失效新机制揭秘：抑制GSK-3β激活Hedgehog信号通路可对抗钛纳米颗粒诱导的成骨抑制
一、 研究团队与发表信息
本研究由来自中国苏州大学第一附属医院骨科的王清、张伟、彭晓乐等为主要完成人，通讯作者为苏州大学第一附属医院的徐耀增、刘宇、周军、耿德春。该研究成果于2022年以题为“GSK‑3β suppression upregulates gli1 to alleviate osteogenesis inhibition in titanium nanoparticle‑induced osteolysis”的研究论文形式，发表于国际期刊《Journal of Nanobiotechnology》。
二、 学术背景与研究目标
主要科学领域： 本研究属于骨科学、生物材料学与分子生物学的交叉领域，聚焦于人工关节置换术后并发症——假体周围骨溶解（Periprosthetic Osteolysis， PPO）的病理机制与潜在治疗策略。
研究背景与动机： 全关节置换术（Total Joint Arthroplasty， TJA）是治疗严重关节疾病的有效手段，但长期并发症，特别是由植入物磨损颗粒引发的PPO，是导致假体无菌性松动和手术失败的主要原因，对全球公共卫生构成严重威胁。传统的翻修手术不仅费用高昂，且术后效果和假体存活期有限，因此深入探究PPO的病理机制、寻找新的预防和治疗靶点迫在眉睫。
既往研究已明确，植入物摩擦产生的纳米级磨损颗粒（如钛、铬、聚乙烯等）是PPO的始动因素。这些颗粒会引发局部强烈的免疫炎症反应，破坏成骨细胞主导的骨形成与破骨细胞主导的骨吸收之间的平衡。尽管针对炎症和破骨细胞活化的疗法取得一定进展，但单纯抑制骨吸收并不能有效阻止PPO，提示成骨抑制在骨丢失过程中扮演着协同甚至关键角色。然而，关于磨损颗粒如何抑制成骨的深层分子机制尚不完全清楚。
Hedgehog（Hh）信号通路在脊椎动物的骨骼发育、稳态维持及细胞分化中至关重要，其核心下游转录因子Gli1的活性受复杂机制调控。研究表明，激活Hh-Gli1通路能促进间充质干细胞向成骨细胞分化并增加骨量。但该通路是否参与磨损颗粒诱导的成骨抑制，此前未有报道。
基于此，本研究团队提出假说：钛（Ti）纳米颗粒诱导的PPO与成骨抑制密切相关，而这一抑制是由Hh-Gli1信号通路直接受损介导的。其研究目标是：在体外和体内模型中，探究钛纳米颗粒对成骨细胞功能的抑制作用，并阐明其分子机制是否涉及糖原合成激酶3β（Glycogen Synthase Kinase 3β， GSK-3β）对Hh-Gli1信号的负向调控，从而为开发针对PPO的新疗法提供理论依据。
三、 详细研究流程
本研究采用了系统性的体外细胞实验与体内动物模型相结合的策略，流程清晰，环环相扣。
1. 体外细胞实验部分： * 研究模型： 使用小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1作为研究对象。 * 颗粒表征与细胞毒性测试： 首先，通过扫描电子显微镜（SEM）和ImageJ软件对购买的钛纳米颗粒进行形貌和粒径分析，确认其平均直径约为90纳米，形态不规则。使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）检测不同浓度钛颗粒处理不同时间后对MC3T3-E1细胞活力和增殖的影响，确定后续实验使用的无毒性或低抑制性的颗粒浓度（2.5 µg/cm² 和 5 µg/cm²）。 * 成骨抑制表型验证： * 分子水平： 将细胞分为对照组、成骨诱导组（0 µg/cm² Ti）、低剂量和高剂量钛颗粒处理组（2.5和5 µg/cm² Ti）。通过实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）和蛋白质印迹法（Western Blot）检测成骨关键标志物（Runx2、OCN、Osterix）的mRNA和蛋白表达水平。 * 功能水平： 在成骨诱导培养基中培养7天和21天后，分别进行碱性磷酸酶（ALP）染色与活性定量（评估早期成骨分化能力），以及茜素红S（ARS）染色与定量（评估晚期钙化结节形成能力，即矿化能力）。 * 机制探究： * Hh-Gli1通路检测： 同样使用qRT-PCR、Western Blot检测Gli1的mRNA和总蛋白水平。进一步通过核质蛋白分离技术结合Western Blot，以及细胞免疫荧光染色，特异性地分析Gli1蛋白在细胞质和细胞核内的分布与积累情况，评估其核转位活性。 * GSK-3β活性检测： 使用Western Blot检测总GSK-3β蛋白及其在Ser9位点磷酸化（pSer9-GSK-3β）的水平。pSer9-GSK-3β是GSK-3β的失活形式，其比例降低代表GSK-3β活性升高。 * 干预实验（功能回复与阻断）： * 功能回复实验： 在钛颗粒处理的基础上，加入GSK-3β的选择性抑制剂TWS119。首先通过CCK-8确定TWS119的安全工作浓度（1 µM和2 µM）。随后，检测TWS119处理后，pSer9-GSK-3β/Gli1蛋白水平/核转位、成骨标志物表达以及ALP/ARS成骨能力的变化，验证抑制GSK-3β能否逆转钛颗粒的效应。 * 通路特异性阻断实验： 为进一步证明TWS119的作用是通过Hh-Gli1通路介导，在TWS119和钛颗粒共处理的基础上，加入Gli1的选择性抑制剂Gant58（通过CCK-8确定安全浓度10 µM）。观察Gant58是否能够抵消TWS119对成骨分化的保护作用。
2. 体内动物实验部分： * 研究模型： 建立经典的钛颗粒诱导的小鼠颅骨骨溶解模型。选用8周龄雄性C57BL/6小鼠，随机分为4组（每组n=10）：假手术组（仅注射PBS）、模型组（注射含40mg钛颗粒的PBS）、TWS119治疗组（模型+每日腹腔注射TWS119， 10 mg/kg）、TWS119+Gant58共处理组（模型+TWS119+Gant58腹腔注射， 20 mg/kg）。手术14天后处死小鼠，收取颅骨。 * 骨量及骨微结构分析： 使用高分辨率微型计算机断层扫描（Micro-CT）对颅骨进行扫描和三维重建。在颗粒暴露区域的感兴趣区（ROI）内，量化分析骨体积分数（BV/TV）、骨表面积/骨体积比（BS/BV）、骨小梁数量（Tb.N）和总孔隙率等骨形态计量学参数，客观评估骨破坏程度。 * 组织学分析： * 骨破坏与形态评估： 颅骨样本经脱钙、包埋、切片后，进行苏木精-伊红（H&E）染色。通过测量被侵蚀骨表面积占总骨表面积的比值（EBS/BS）和平均骨厚度（Bone Thickness），定量分析骨侵蚀程度和纤维组织增生情况。 * 新生骨形成评估： 使用马松三色（Masson Trichrome）染色，新生未成熟胶原纤维染为蓝色。通过量化蓝色区域的面积百分比（胶原体积分数），评估各组小鼠颅骨的新骨形成能力。 * 安全性评估： 收取各组小鼠的肺、肝、肾组织进行H&E染色，观察TWS119和Gant58治疗是否产生明显的器官毒性。
3. 数据分析方法： 所有定量数据均以均值±标准差表示。使用GraphPad Prism 7.0软件进行统计分析。多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两组间比较采用Student’s t检验。以P < 0.05为差异具有统计学意义。
四、 主要研究结果
1. 钛纳米颗粒显著抑制MC3T3-E1细胞的成骨能力。 * 分子表达下调： qRT-PCR和Western Blot结果显示，与单纯成骨诱导组（0 µg/cm²）相比，钛颗粒处理剂量依赖性地显著降低了Runx2、OCN、Osterix的mRNA和蛋白表达水平。 * 功能受损： ALP染色显示，钛颗粒处理显著降低了ALP活性（高剂量组降低约68.57%）。ARS染色显示，钛颗粒处理显著减少了钙结节的形成（高剂量组吸光度降低约53.9%）。免疫荧光染色直观显示，钛颗粒处理组中Runx2（核内）和OCN的荧光强度明显减弱。 * 结论： 钛纳米颗粒在体外能有效抑制成骨细胞的分化和矿化功能。
2. 钛颗粒处理导致Hh-Gli1信号通路失活。 * 转录与翻译解耦： qRT-PCR显示钛颗粒处理并未显著改变Gli1的mRNA水平。然而，Western Blot显示Gli1的总蛋白水平显著下降。 * 核转位受阻： 核质分离Western Blot和免疫荧光染色结果一致表明：成骨诱导能促进Gli1蛋白在细胞质和细胞核（尤其是细胞核）中积累；而钛颗粒处理不仅降低了总Gli1蛋白，更特异地显著减少了其在细胞核内的定位和积累，表明其核转位过程受到损害。 * 结论： 钛颗粒在翻译后水平促进了Gli1蛋白的降解并阻碍其入核，从而抑制了Hh信号通路的转录活性。
3. 钛颗粒激活的GSK-3β参与Gli1蛋白降解。 * GSK-3β被激活： Western Blot显示，钛颗粒处理虽未改变总GSK-3β蛋白量，但显著降低了其失活形式pSer9-GSK-3β的水平，导致pSer9-GSK-3β/总GSK-3β比值下降，证实GSK-3β激酶活性被上调。 * 抑制GSK-3β可恢复Gli1： 使用TWS119抑制GSK-3β后，能够逆转钛颗粒引起的pSer9-GSK-3β降低。更重要的是，TWS119处理显著增加了Gli1蛋白在细胞质和细胞核（特别是核内）的积累，恢复了其核转位。这直接证明激活的GSK-3β是导致Gli1降解和功能丧失的关键上游激酶。
4. 抑制GSK-3β通过激活Hh-Gli1通路挽救成骨抑制。 * 成骨表型恢复： TWS119处理能显著逆转钛颗粒引起的成骨标志物（Runx2、OCN、Osterix）表达下调，并恢复ALP活性和矿化结节形成能力。 * 通路特异性验证： 当同时使用Gli1抑制剂Gant58时，TWS119对成骨分化的所有保护作用均被显著削弱或完全阻断。这提供了确凿证据，表明TWS119促进成骨的作用是依赖於Hh-Gli1信号通路的激活。
5. 体内实验证实GSK-3β介导的Hh-Gli1机制。 * Micro-CT结果： 模型组小鼠颅骨出现大面积骨侵蚀，BV/TV和Tb.N显著降低，总孔隙率显著升高。TWS119治疗显著减轻了骨破坏，改善了上述所有骨微结构参数。然而，TWS119的治疗效果在联合使用Gant58后被明显抵消。 * 组织学结果： H&E染色显示模型组骨表面严重侵蚀和纤维化，TWS119治疗组明显改善，而联合Gant58组改善不显著。Masson染色显示，TWS119治疗组新生胶原纤维（蓝色）面积显著多于模型组，表明新骨形成增强，但该效应同样被Gant58阻断。 * 安全性： 主要器官H&E染色未发现明显病理改变。 * 结论： 体内实验完美复现并验证了体外发现的机制：抑制GSK-3β可通过激活Hh-Gli1信号通路，减轻钛颗粒诱导的骨溶解并促进成骨，且此作用具有通路特异性。
五、 研究结论与价值
研究结论： 本研究发现，钛纳米颗粒通过异常激活GSK-3β，触发Hh信号通路关键转录因子Gli1的翻译后修饰和降解，抑制其核转位，从而导致成骨抑制。药理学抑制GSK-3β可上调Gli1、激活Hh信号，从而有效挽救钛颗粒诱导的成骨抑制和骨溶解。这表明GSK-3β介导的Hh-Gli1信号损伤是磨损颗粒诱导PPO的重要病理机制之一。
科学价值： 1. 机制创新： 首次在PPO背景下，揭示了磨损颗粒、GSK-3β激酶活性、Hh-Gli1信号通路与成骨抑制之间的因果联系链条，深化了对PPO“成骨侧”病理机制的理解。 2. 靶点发现： 明确了GSK-3β和Hh-Gli1通路可作为治疗PPO的潜在新靶点。特别是GSK-3β抑制剂（如TWS119）展现出良好的治疗前景。 3. 研究范式： 提供了从分子、细胞到动物模型的完整证据链，为后续相关研究提供了方法论参考。
应用价值： 1. 药物研发新方向： 为开发旨在“促进成骨”而非单纯“抑制破骨”的PPO治疗药物提供了明确的理论靶点。针对GSK-3β或下游Hh通路的小分子激动剂可能成为新型治疗策略。 2. 临床治疗新思路： 提示未来可能通过局部药物缓释涂层、生物材料改性等手段，在植入物界面调控GSK-3β/Hh信号，主动增强骨整合、预防骨溶解。
六、 研究亮点
七、 其他说明
研究团队在讨论部分也客观指出了本研究的局限性：例如，主要使用了钛颗粒模型，而临床上聚乙烯颗粒更为常见；虽然机制相似，但未来仍需在更贴近临床的模型中进行验证。此外，Hh-Gli1信号是否通过成骨细胞影响其他骨代谢细胞（如免疫细胞、破骨细胞）也未探讨，这为未来研究留下了空间。这些反思体现了研究的科学严谨性。