本研究报告是基于由中国学者主导、发表在《Emerging Microbes & Infections》期刊上的一项原创性研究成果。该研究于2023年8月28日在线发表，标题为“Identification of TMEM53 as a novel SADS-CoV restriction factor that targets viral RNA-dependent RNA polymerase”， 其作者团队主要来自中国科学院武汉病毒研究所（第一作者为姚玉林、罗云、王琪，通讯作者为周鹏和石正丽研究员），同时包括中国科学院大学和广州实验室的研究人员。
本研究属于病毒学与宿主-病原体相互作用领域，特别聚焦于新发人兽共患冠状病毒的防控基础研究。过去二十年，严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）和SARS-CoV-2的流行，深刻揭示了冠状病毒跨物种传播对全球公共卫生构成的严重威胁。猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS-CoV）是2016-2017年在中国广东猪群中暴发的一种高致死性肠道病原体，其起源于蝙蝠HKU2相关冠状病毒。尽管目前尚未有人类感染病例报告，但前期研究表明SADS-CoV能在多种哺乳动物细胞（包括原代人肺和肠道细胞）中高效复制，提示其具有潜在的跨种传播风险。目前，针对SADS-CoV既无美国食品药品监督管理局（FDA）批准的特效药物，也无可用疫苗，且其特异性受体尚未明确，使得传统的受体阻断策略难以应用。因此，深入理解宿主限制病毒感染的细胞内在因素，对于开发针对此类潜在人兽共患病毒的有效干预策略和治疗手段至关重要。
在此背景下，本研究团队旨在系统性筛选并鉴定能够限制SADS-CoV感染的新型宿主限制因子。研究团队前期的努力已通过全基因组CRISPR-Cas9筛选发现了病毒复制所需的宿主依赖性因子（如ZDhhC17）。而本研究则转换思路，利用功能获得性（gain-of-function）筛选策略，寻找能够主动抑制病毒复制的宿主蛋白，以期发现新的抗病毒药物靶点，并为应对未来可能由HKU2相关冠状病毒引发的人类疫情做好储备。
本研究遵循了从大规模筛选、候选基因验证、作用机制解析到广谱抗病毒活性评估的完整科学流程，主要包含以下几个关键步骤：
第一步骤：人cDNA文库构建与功能性筛选 研究团队首先建立了高通量筛选平台。他们使用经广谱I型干扰素（IFN）处理的Huh7细胞（人肝癌细胞系）构建了一个富含抗病毒基因的cDNA文库，并将其包装成慢病毒。随后，将该慢病毒cDNA文库转导至对SADS-CoV感染敏感且能产生明显细胞病变效应的HeLa细胞中，并通过抗生素（杀稻瘟菌素）筛选获得稳定整合了cDNA片段的细胞池。接着，用SADS-CoV（感染复数MOI=0.1）反复感染该细胞池三轮，每次感染后存活下来的细胞被认为是表达了潜在抗病毒cDNA的细胞。经过三轮富集后，收集存活细胞，提取基因组DNA，通过二代测序和生物信息学分析（使用HISAT2和StringTie进行比对和注释，使用DESeq2进行差异表达分析），鉴定出在存活细胞中显著富集的cDNA序列。筛选阈值设定为测序读数>10^4且log2（差异倍数）>2。通过此方法，成功筛选出四个候选基因：CD14、CLU、TMEM53和LY6E。
第二步骤：候选基因的初步验证与TMEM53的选定 为了验证筛选结果，研究者在HeLa、Huh7和HEK293T细胞中分别过表达了这四个候选基因，并检测其对SADS-CoV感染的影响。结果显示，只有TMEM53和LY6E能显著抑制SADS-CoV的复制（通过检测病毒RNA和核蛋白NP表达量）。考虑到跨膜蛋白（TMEM）家族成员在细胞生物学中的重要性以及TMEM53功能未知的特性，研究者选择TMEM53作为深入研究的对象。为了排除瞬时转染带来的变异，他们构建了稳定表达TMEM53和LY6E的HeLa和Huh7细胞系。在这些稳转细胞系中，TMEM53和LY6E均能显著降低病毒RNA水平、NP蛋白表达以及上清液中的病毒滴度（TCID50测定）。此外，研究团队还构建了带有荧光报告基因mNeonGreen的SADS-CoV重组病毒（SADS-CoV-MNG），感染实验直观地证实了TMEM53对病毒复制的抑制。为了确认内源性TMEM53的功能，他们利用CRISPR-Cas9系统敲除了Huh7和HeLa细胞中的TMEM53基因。敲除细胞在感染SADS-CoV后，病毒复制水平显著增强。这些实验共同证实了TMEM53是一个真正的SADS-CoV限制因子，且其对细胞活力无明显影响。
第三步骤：TMEM53作用环节与机制的初步探索 明确了TMEM53的抗病毒活性后，研究者开始探究其作用机制。首先，他们通过病毒附着与内吞实验排除了TMEM53影响病毒进入环节的可能性（LY6E作为阳性对照，可抑制病毒进入）。接着，通过时间进程实验发现，TMEM53在感染后8小时开始显著抑制病毒RNA总量的积累，提示其可能靶向病毒RNA合成。通过检测病毒复制中间产物——双链RNA（dsRNA）、正链/负链病毒RNA（+/- vRNA）和亚基因组RNA（sgRNA），进一步证实TMEM53抑制的是病毒的RNA合成。更重要的是，研究者构建了一个不表达刺突蛋白、无法产生感染性病毒颗粒的SADS-CoV复制子系统（SADS-CoV-NLuc），该系统仅依赖病毒自身的复制转录机制。在该系统中，TMEM53同样能强烈抑制报告基因NLuc的表达，而LY6E无此效果，这确凿地证明TMEM53靶向的是病毒基因组的复制过程，而非病毒进入。
第四步骤：排除干扰素途径依赖性与寻找直接作用靶点 鉴于许多跨膜蛋白家族成员（如TMEM173/STING）参与抗病毒天然免疫，研究者检验了TMEM53的作用是否依赖于经典的I型干扰素通路。结果显示，SADS-CoV感染或外源性I型IFN处理均不能诱导TMEM53的mRNA表达。同时，TMEM53的过表达也不影响由仙台病毒（SeV）触发的IFN-β或干扰素刺激反应元件（ISRE）报告基因的活化，也不改变I型IFN通路下游干扰素刺激基因（ISGs）的诱导水平。最关键的是，在敲除了I型IFN信号通路关键分子STAT1的Huh7细胞中，TMEM53的抗病毒活性依然完好无损。这些证据强有力地表明，TMEM53是一个不依赖于干扰素产生或信号传导的细胞内在抗病毒效应分子，其作用方式可能是直接靶向病毒的复制机器。
第五步骤：TMEM53靶向病毒RdRp复合体并破坏其组装 基于TMEM53抑制病毒RNA合成的发现，研究团队将目光投向冠状病毒复制转录复合体的核心——RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）。冠状病毒的RdRp核心复合体由催化亚基Nsp12和两个辅助因子Nsp7、Nsp8组成。研究者首先通过RNA免疫共沉淀（RIP）实验排除了TMEM53直接结合病毒RNA的可能性。接着，他们建立了一个细胞内的SADS-CoV RdRp活性报告系统。该系统包含一个报告质粒，当病毒Nsp12（或与Nsp7/Nsp8一起）表达时，能启动报告基因NanoLuc（NLuc）的表达，从而定量反映RdRp的活性。实验发现，在过表达TMEM53的细胞中，由Nsp12或Nsp12/Nsp7/Nsp8复合体驱动的RdRp活性被显著抑制。
随后，通过免疫共沉淀（Co-IP）、免疫荧光共定位和更灵敏的近端连接实验（PLA），研究团队证实TMEM53能够与病毒蛋白Nsp12和Nsp8发生特异性物理相互作用，但与Nsp7不结合。通过构建Nsp12的截短体进行结构域映射，发现TMEM53与Nsp12的相互作用依赖于其N端区域（即缺乏核心RdRp结构域的δRdRp区域）。一个关键的发现是：TMEM53的存在会显著破坏Nsp8与Nsp12之间的相互作用，但并不影响Nsp7与Nsp8之间异源二聚体的形成。这些数据清晰地揭示，TMEM53通过结合Nsp12和Nsp8，干扰了功能性RdRp核心复合体（Nsp12-Nsp8）的正确组装，从而抑制了其聚合酶活性和后续的病毒RNA合成。
第六步骤：TMEM53跨膜结构域对其功能至关重要 TMEM53是一个预测的跨膜蛋白。为了探究其跨膜结构域（TM）的功能，研究者构建了缺失TM结构域的突变体（TMEM53-δTM）。结果显示，该突变体丧失了大部分抗SADS-CoV的活性。进一步的细胞定位研究表明，野生型TMEM53定位于内质网和高尔基体（二者是冠状病毒复制的重要场所），而缺失TM结构域的突变体则错误定位，无法与Nsp12结合，也失去了破坏Nsp12-Nsp8相互作用以及抑制RdRp活性的能力。这表明TMEM53的跨膜结构域对其正确的亚细胞定位、与病毒靶蛋白的相互作用以及最终的抗病毒功能都是不可或缺的。
第七步骤：TMEM53抗病毒活性的物种特异性评估 最后，研究者评估了TMEM53抗病毒谱的广度。实验表明，TMEM53对包括SARS-CoV-2、蝙蝠SARS相关病毒WIV1、MERS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-229E在内的其他冠状病毒，以及单纯疱疹病毒1型（HSV-1）和甲型流感病毒（PR8）均无明显的抑制作用。然而，考虑到SADS-CoV起源于蝙蝠HKU2相关冠状病毒（HKU2r-CoVs），研究团队构建了另外两种蝙蝠HKU2r-CoVs（162140-CoV和HKU2-CoV）的复制子系统。令人振奋的是，TMEM53同样能强力抑制这两种病毒的复制子活性。序列比对分析显示，HKU2r-CoVs的Nsp12蛋白序列高度相似，而与其他冠状病毒（如SARS-CoV-2）差异较大。Co-IP实验证实，TMEM53能与HKU2r-CoVs的Nsp12有效结合，但不能与SARS-CoV-2的Nsp12结合。因此，TMEM53是一个高效的HKU2相关冠状病毒物种特异性限制因子。
本研究的结论是：跨膜蛋白TMEM53是一个新发现的、不依赖干扰素信号的细胞内在宿主限制因子。它通过特异性结合HKU2相关冠状病毒的Nsp12和Nsp8蛋白，破坏病毒RdRp核心复合体的组装，进而抑制病毒RNA合成，从而发挥抗病毒作用。TMEM53展示了针对HKU2相关冠状病毒属的广谱抑制活性。
本研究的科学价值和应用价值显著： 1. 科学价值： * 新功能发现：首次揭示了TMEM蛋白家族成员TMEM53在抗病毒防御中的新功能，拓宽了对宿主限制因子家族的认识。 * 机制创新：发现了一种全新的冠状病毒限制机制——通过破坏RdRp辅助因子与催化亚基的相互作用来抑制病毒复制，这为理解宿主与冠状病毒的军备竞赛提供了新视角。 * 靶点明确：将作用机制精确到与Nsp12 N端结构域的相互作用，为后续基于结构的药物设计或模拟TMEM53作用机理的肽类/小分子抑制剂开发指明了方向。 2. 应用价值： * 药物靶点储备：TMEM53本身或其作用通路中的关键界面，可作为开发抗HKU2相关冠状病毒（包括具有潜在人兽共患风险的SADS-CoV）新型宿主导向疗法的有前景靶点。 * 疫情防范：研究针对目前尚无人类感染但具有高溢出风险的病毒进行前瞻性布局，体现了“防患于未然”的防疫思路，为应对未来可能由这类病毒引发的新发传染病提供了知识储备和潜在干预策略。
研究中构建的一系列工具和方法具有重要价值，包括：SADS-CoV荧光报告病毒（SADS-CoV-MNG）、SADS-CoV及其相关病毒（162140-CoV， HKU2-CoV）的复制子系统、以及细胞内的SADS-CoV RdRp活性报告系统。这些工具不仅服务于本研究，也将为后续针对这类病毒的药物筛选、抗体评估和基础研究提供便利。此外，研究中对公共单细胞RNA测序数据的分析，显示TMEM53在肺和肠道等冠状病毒靶细胞中有一定表达，为其生理条件下的防御角色提供了线索。