基于模板导向策略的位点特异性修饰长链RNA合成及mRNA翻译的位点效应研究

主要作者及发表信息

本研究由潘宇凡、朱晨佑（共同第一作者）以及通讯作者董元辰、刘冬生和张希等人合作完成。研究团队主要来自清华大学化学系、中国科学院化学研究所以及香港理工大学等机构。该研究成果于2025年10月16日在线发表于《Journal of the American Chemical Society》（J. Am. Chem. Soc.）。

学术背景与研究目的

信使核糖核酸（messenger RNA, mRNA）作为连接基因组与蛋白质组的关键桥梁，在细胞分化、组织发育、疾病和免疫中扮演着至关重要的角色。近年来，基于体外合成mRNA的疗法在遗传代谢疾病治疗、肿瘤治疗、疫苗开发等临床应用中展现出巨大潜力，尤其是在新冠mRNA疫苗中取得了举世瞩目的成功。然而，常规mRNA的强免疫原性（immunogenicity）和弱稳定性限制了其临床应用。化学修饰是克服这些挑战的最广泛策略。在哺乳动物转录组中已发现超过170种化学修饰，例如N6-甲基腺苷（m6A）、假尿苷（ψ）和5-甲基胞嘧啶（m5C），它们可影响mRNA的结构、稳定性和功能。例如，m6A可以促进翻译起始并改变mRNA降解速率，而ψ存在于终止密码子时可导致翻译通读（read through）。将尿苷修饰为ψ或N1-甲基假尿苷（m1ψ）还能有效降低外源mRNA的免疫原性，这也是新冠mRNA疫苗成功的关键技术之一。

尽管修饰核苷在调节免疫原性和稳定性方面表现出色，但越来越多的证据表明，同一种修饰在mRNA的不同位点可能发挥截然不同甚至相反的功能。例如，m6A位于5’-非翻译区（5’-UTR）可促进翻译，但位于编码序列（coding sequence, CDS）则会减慢翻译速度。另一项近期研究揭示，mRNA疫苗中最广泛使用的m1ψ修饰在特定密码子会导致核糖体+1移码（+1 frameshifting），从而产生脱靶蛋白，引发了人们对修饰mRNA安全性的担忧，即错误修饰或过度修饰可能带来生物安全风险。

然而，由于现有技术只能对RNA进行随机或完全替换式的修饰，缺乏在长链RNA上实现单碱基分辨率（single-base resolution）的位点特异性修饰的合成方法，极大限制了对化学修饰精确功能和机制的深入研究。因此，开发一种能够以单碱基精度制备位点特异性修饰长链单链RNA的新型技术，以揭示化学修饰的位点效应并为下一代mRNA药物设计提供指导，成为了亟待解决的关键科学问题。

详细研究工作流程

本研究提出并验证了一种基于模板导向连接策略（template-directed ligation strategy）的方法，用于合成长链、具有单碱基分辨率的位点特异性修饰单链RNA（ssRNA），并利用该方法阐明了m1ψ修饰对翻译保真度（translation fidelity）的位点特异性效应。

研究的实验流程主要包括四个步骤： 1. 合成方法的建立与优化： * 研究对象：未修饰的长链ssRNA。 * 实验流程：该方法采用商业化且通过固相合成（solid-phase synthesis）制备的、长度约为30个核苷酸（nt）的短RNA片段作为起始材料。设计一条与目标序列完全互补的DNA模板链，短RNA片段通过碱基互补配对与DNA模板杂交，组装成完整的序列。随后，加入T4 RNA连接酶2（T4 RNA ligase 2），一种高效的双链RNA连接酶，催化相邻RNA片段间磷酸二酯键的形成进行共价连接。连接完成后，使用DNase酶消化DNA模板，即可获得目标长链ssRNA产物。 * 技术优化：研究团队系统优化了合成条件。他们最初使用30 nt的短DNA模板，但发现合成具有复杂二级结构的内核糖体进入位点（Internal Ribosome Entry Site, IRES，如丙型肝炎病毒HCV IRES和新冠病毒SARS-CoV-2 5’UTR）时产率极低（8%）。通过将DNA模板长度延长至与目标RNA完全互补（全长模板），将HCV IRES的合成产率显著提高至27%，306 nt的Co5u RNA产率达到32%。研究认为，全长模板通过扩展连续杂交区域增强组装体稳定性、降低对RNA与DNA化学计量比的依赖性，以及产生协同动力学互锁效应，是效率提升的关键。对反应缓冲液、退火速率和金属离子的优化发现，线性缓慢降温（-0.5 °C/min）优于快速降温，二价金属离子（Mg2+、Ca2+）因能屏蔽电荷、增强连接酶活性且不促进复杂非双链结构，效果优于一价离子。研究最终确定RNA片段与DNA模板的最适化学计量比为1:1，而最适RNA片段长度约为30 nt。 2. 位点特异性修饰的通用性验证： * 研究对象：合成了携带不同类型单修饰的长链ssRNA，包括天然修饰（m6A、m5C、ψ、I）和人工修饰（m1ψ、br-du、2’-F、2’-OMe、2’-MOE、2’-炔丙基、LNA、cet），总计16种。将修饰设计在120 nt RNA的第75位核苷酸。 * 实验方法：利用固相合成将特定修饰预先引入短RNA片段的指定位点，再通过上述模板导向连接法整合到长链RNA中。 * 数据与验证：通过10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析，所有反应均显示清晰的产物条带，证实了该方法对多种化学修饰具有广泛兼容性，且不影响合成效率。为检测修饰的准确性，对m6A修饰的HCV IRES和Co5u RNA进行了GLORI 2.0测序，结果与设计完全一致，实现了100%的位点特异性，甚至在连续相同核苷酸（如A154和A155）中也展现了单碱基分辨率的修饰能力。同时，通过bs-seq和bid-seq等技术，也验证了在同一条RNA分子中同时引入两种（m5C和m6A）或三种（m5C、ψ和m6A）不同修饰的成功精确性。 3. m1ψ修饰对翻译保真度的位点效应研究： * 研究对象：设计了一系列在特定“滑动位点”（slippery site, UUUC）具有不同m1ψ修饰模式的mRNA序列，编码HiBiT报告肽。该序列天然产生无活性的10个氨基酸的多肽，发生+1移码时才翻译出有活性的22个氨基酸多肽，可产生化学发光信号。 * 实验流程与结果：将具有不同m1ψ修饰模式（如m1ψm1ψm1ψC, m1ψm1ψUC, UUm1ψC等）的mRNA转染HeLa细胞。结果显示，含有UUU密码子且前两位为m1ψ的mRNA表现出很高的移码效率，与全m1ψ修饰的mRNA类似。然而，当m1ψ仅位于第三位（UUm1ψC模式）时，其+1移码率是所有修饰模式中最低的，几乎与未经修饰的天然UUUC序列相同。该趋势在HepG2和293T细胞中也得到验证。作者解释，m1ψ由于空间位阻阻碍了与腺嘌呤（A）的氢键配对，连续m1ψ会降低密码子-反密码子螺旋的稳定性，导致核糖体停滞并引发移码；但在第三位引入m1ψ时，由于该位置的配对最为微弱，其解码速率与未修饰的相当，因此不诱发移码。 4. 位点特异性修饰mRNA的免疫原性评估： * 研究对象：上一步中合成的位点特异性m1ψ修饰的mRNA。 * 实验方法：将上述mRNA转染至小鼠稳定巨噬细胞系RAW264.7，通过RT-qPCR定量检测多种促炎细胞因子和趋化因子（IL-6, IFN-β, TNF-α, IL-1β, CCL-2）的mRNA表达水平。 * 实验结果：与阳性对照polyIC相比，所有位点特异性m1ψ修饰的mRNA均显示出低免疫原性，其水平与完全m1ψ修饰的mRNA相似，表明该特定修饰模式在提升翻译保真度的同时，成功维持了低免疫原性。

主要结论与研究价值

本研究成功开发了一种基于DNA模板导向连接的、通用且可扩展的新方法，能够以单碱基分辨率高效制备长达数百个核苷酸、携带任意一种或多种修饰的位点特异性长链ssRNA。利用此方法，首次在单碱基精度上揭示了m1ψ修饰对翻译移码的位点依赖性效应，并成功鉴定出既能维持低免疫原性又能显著提高翻译保真度的最优修饰模式（UUm1ψC）。

该研究的科学价值在于，它为RNA修饰的精准功能机制研究提供了一个前所未有的强大工具，有助于深入理解“RNA表观遗传学”的分子基础。其应用价值在于，为mRNA药物的修饰设计提供了超越随机或完全修饰的新范式——即“精准修饰”的指导原则，有助于开发出更安全（减少脱靶移码）、更有效的下一代mRNA疗法和疫苗。

研究亮点

本研究的亮点主要体现在三个方面： 1. 方法学创新：摒弃了传统体外转录（IVT）只能进行随机或完全修饰的局限，巧妙地将固相合成的高精度与酶法连接长链RNA的能力相结合，实现了在长链RNA分子上以单碱基分辨率进行任意位点、多种类修饰的精准“写入”。 2. 关键发现：首次在单碱基水平上定量阐明了m1ψ修饰对核糖体移码的位点特异性影响，并发现仅将m1ψ置于UUU密码子第三位即可消除移码突变。这一发现为优化mRNA疫苗序列、消除因m1ψ修饰引起的非预期免疫原性或毒性提供了明确、具体的设计思路。 3. 概念的验证与推广：该研究不仅提供了强大的合成平台，还通过“翻译保真度”和“免疫原性”这两个mRNA药物最关键的指标，完美展示了该方法用于指导mRNA药物设计的巨大潜力，体现了从“方法开发”到“功能验证”再到“转化应用”的完整逻辑链条。