本研究由Fan Zhang和Zhou Ye（共同第一作者）、Yingqi Ran、Cong Liu、Mingtao Zhang、Xiangchang Xu、Fengqing Song（通讯作者）及Lan Yao（通讯作者）等人完成。研究机构包括中山大学附属第五医院急诊医学科、中山大学孙逸仙纪念医院急诊医学科以及中山大学心肺脑复苏研究所。该论文于2024年5月3日在线发表于*European Journal of Pharmacology*（《欧洲药理学杂志》）第974卷，文章编号176633。
心脏骤停（cardiac arrest，CA）是全球医疗系统面临的重大挑战。仅在中国，每年约有55万人发生心脏骤停，院外生存率不足1%。即使患者成功恢复自主循环（return of spontaneous circulation，ROSC），死亡率仍然居高不下。复苏后心肌功能障碍（post-resuscitation myocardial dysfunction，PRMD）是导致ROSC后全身循环衰竭和死亡率增加的关键因素之一。PRMD的核心病理机制是心肌缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤，其涉及氧化应激、微血管功能障碍、炎症反应、细胞凋亡和线粒体功能障碍等多种病理过程。其中，线粒体功能障碍在心脏I/R损伤的发生发展中起着至关重要的作用。线粒体自噬（mitophagy）作为一种选择性降解受损线粒体的自噬形式，是维持线粒体稳态的关键机制。当受损线粒体无法修复时，线粒体自噬通过清除缺陷线粒体来保护细胞免于凋亡和坏死。
钌红（ruthenium red，RR）是一种已知的钙离子通道抑制剂。既往研究表明，RR通过抑制线粒体钙单向转运体（mitochondrial calcium uniporter，MCU）促进线粒体自噬，从而减轻心脏I/R损伤。然而，MCU抑制并非RR发挥作用的唯一机制，RR诱导的线粒体自噬的确切分子通路及其对PRMD的影响尚不清楚。因此，本研究旨在利用大鼠心脏骤停模型，探讨RR对PRMD的治疗效果及其潜在分子机制。
本研究采用雄性Sprague-Dawley大鼠（300–350日龄，体重500–600 g）作为研究对象。全部36只大鼠被随机分为三组：假手术组（sham组，n=12）、心肺复苏组（CPR组，n=12）和钌红治疗组（RR组，n=12）。CPR组和RR组的大鼠进一步按ROSC后3小时和24小时两个时间点各分为两个亚组（每亚组n=6）。
心脏骤停模型的建立流程如下：大鼠经戊巴比妥钠麻醉后行气管插管和机械通气，左股动脉置管用于血压监测。将导丝插入食管心脏后方以诱导心室颤动（ventricular fibrillation，VF），维持电流3分钟以防止VF自行恢复。经过8分钟未处理的心室颤动后，开始机械通气（潮气量0.6 ml/100g，通气频率60次/分，100%氧气），同时进行6分钟的心肺复苏（胸外按压频率250次/分）。心肺复苏4分钟后给予肾上腺素（0.02 mg/kg），6分钟后尝试3焦耳双向波电击除颤。ROSC定义为有组织心律且平均动脉压大于60 mmHg持续至少10分钟。RR组大鼠在ROSC起始时腹腔注射RR（2.5 mg/kg，以纯化水为溶剂），CPR组给予等量溶剂。
本研究包含多个层面的检测程序。在心肌损伤和心功能评估方面，采用ELISA法检测血清心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）和肌酸激酶同工酶MB（creatine kinase-MB，CK-MB）水平，使用超声心动图（Vevo 3100，配备MX250线阵探头）测量左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）和左心室短轴缩短率（left ventricular fractional shortening，LVFS）。在组织病理学方面，通过苏木精-伊红（H&E）染色评估心肌组织形态学改变，通过TUNEL染色检测心肌细胞凋亡。在氧化应激评估方面，采用2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH2-DA）荧光探针检测心肌活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，同时检测丙二醛（malondialdehyde，MDA）和氧化型谷胱甘肽（glutathione disulfide，GSSG）的含量。在线粒体结构和功能评估方面，利用透射电子显微镜（Hitachi HT 7800，120 kV）观察线粒体超微结构，通过靶向代谢组学方法（Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色谱系统联合5500 QTRAP质谱仪，ESI负离子模式，MRM模式检测）定量分析ATP、GTP和AMP等能量代谢物水平。
在分子机制探索方面，研究采用了基于串联质量标签（tandem mass tag，TMT）的定量蛋白质组学技术。左心室组织蛋白经提取、定量后，使用TMT等压质量标签试剂盒进行标记，通过Q Exactive质谱仪偶联Easy nLC进行液相色谱-质谱分析。质谱数据使用Mascot引擎（版本2.2）与Proteome Discoverer 1.4整合进行搜索。差异表达蛋白的筛选标准为倍数变化>1.20或<0.83且p<0.05。差异蛋白进一步进行KEGG通路注释和功能富集分析。此外，通过Western blotting验证了泛素特异性蛋白酶33（ubiquitin-specific protease 33，USP33）、p62和微管相关蛋白轻链3B（LC3B）的蛋白表达水平。最后，通过双重免疫荧光标记技术检测Parkin与线粒体外膜转位酶20（translocase of outer mitochondrial membrane 20，TOMM20）的共定位情况，使用ImageJ软件计算Pearson相关系数和重叠系数以评估Parkin的活化程度。
在基础特征方面，各组大鼠在体重、心率、平均动脉压、核心体温和动物准备时间方面均无显著差异（表1），ROSC后的平均动脉压、心率和核心体温在各组间亦无统计学差异（表2–4，图2），排除了基础生理状态差异对结果的干扰。
在心肌损伤和心功能方面，心脏骤停后CPR组的cTnI和CK-MB水平较假手术组显著升高，而RR给药后两者水平较CPR组明显降低（图3a–b）。超声心动图显示，CPR组在ROSC后3小时和24小时的LVEF和LVFS均较假手术组显著下降，RR组的这两个参数显著高于CPR组（图3c–d）。H&E染色显示，假手术组心肌细胞形态完整、排列整齐；CPR组在ROSC后24小时出现肌细胞溶解和排列紊乱，部分心肌细胞显著肿胀，胞质疏松苍白，细胞间质水肿明显；而RR组心肌纤维保持清晰，细胞形态完整，细胞间质水肿和细胞损伤显著减轻（图3f）。
在细胞凋亡方面，TUNEL染色结果显示，CPR组的凋亡细胞比例较假手术组显著增加，而RR干预后凋亡细胞数量明显减少（图4a–b），表明RR能有效抑制心肌细胞凋亡。
在氧化应激方面，心脏骤停后CPR组和RR组的ROS、GSSG和MDA水平均较假手术组升高。但在ROSC后3小时和24小时，RR组的GSSG和MDA水平低于CPR组；在24小时时间点，RR组的ROS水平也显著低于CPR组（图5a–d），证明RR能够减轻复苏后的心肌氧化应激损伤。
在线粒体形态和能量代谢方面，透射电镜观察显示，CPR组的线粒体出现明显肿胀、嵴溶解和膜损伤，而RR给药有效缓解了线粒体肿胀，减少了线粒体损伤程度（图6）。代谢组学分析显示，与假手术组相比，CPR组的ATP、AMP和GTP水平显著降低，而RR组大鼠的这些代谢物水平显著高于CPR组（图7a–d），说明RR改善了复苏后的生物能量代谢。
在自噬和线粒体自噬方面，TMT定量蛋白质组学共鉴定到5194种蛋白质（1%假阳性率），其中5168种被定量（图8e）。差异表达蛋白分析显示各组间存在显著的蛋白表达差异。KEGG通路富集分析表明，线粒体自噬通路被显著富集（图9a），且自噬相关蛋白在CPR后表达升高，RR组较CPR组表达更高（图9b）。Western blotting验证显示，LC3B-II水平在心脏骤停后升高，RR干预后升高更为显著；而p62水平在心脏骤停后下降，RR干预后进一步降低（图9c–f）。这些结果表明RR增强了复苏后的自噬和线粒体自噬。
在USP33的表达调控方面，蛋白质组学分析显示，USP33在ROSC后表达上调，而RR干预后表达下调（图8c、图10a）。Western blotting验证结果与蛋白质组学一致（图10b–c）。USP33是去泛素化酶家族的成员，已知能够调控PINK1/Parkin介导的线粒体自噬。
在PINK1/Parkin通路激活方面，双重免疫荧光标记显示，RR组的Parkin与TOMM20的共定位Pearson相关系数和重叠系数均显著高于CPR组（图11a–c），表明RR干预后Parkin更多地转位至线粒体外膜，即PINK1/Parkin介导的线粒体自噬被增强。
上述结果形成了完整的逻辑链条：RR通过下调USP33的表达，解除USP33对Parkin的去泛素化抑制作用，促进Parkin向受损线粒体外膜转位，激活PINK1/Parkin信号通路，从而增强线粒体自噬。线粒体自噬的增强清除了受损线粒体，减少了氧化应激的产生，抑制了心肌细胞凋亡，维持了线粒体结构和能量代谢的完整性，最终改善了复苏后心肌功能。
本研究证明，RR通过抑制USP33上调PINK1/Parkin介导的线粒体自噬，从而减轻大鼠心脏骤停模型中的复苏后心肌功能障碍。RR的心脏保护作用可能涉及多种机制，包括抗氧化活性、抑制细胞凋亡以及维持线粒体完整性和能量代谢。
本研究的科学价值在于：首次揭示了RR通过USP33/PINK1/Parkin信号轴调控线粒体自噬的新分子机制，为理解RR在PRMD中的药理作用提供了新的理论依据。同时，研究将蛋白质组学、代谢组学、超微结构观察和功能验证相结合，形成了从整体发现到分子验证的系统研究策略。在应用价值方面，RR作为一种已广泛研究的化合物，具有向临床转化的潜力，为PRMD的早期药物治疗提供了新的候选策略。
本研究的亮点包括：（1）在PRMD模型中首次证明了RR的治疗效果；（2）发现USP33是RR促进线粒体自噬的关键分子靶点，丰富了RR的作用机制谱；（3）采用TMT定量蛋白质组学技术筛选差异蛋白，结合KEGG通路富集分析聚焦于线粒体自噬通路，体现了系统生物学驱动的发现策略。
本研究的局限性包括：仅观察了ROSC后3小时和24小时两个早期时间点，中期和长期的疗效尚需验证；未使用细胞模型深入验证USP33与线粒体自噬之间的因果机制；对线粒体自噬过程中线粒体膜电位的变化未做进一步检测。未来研究应进一步阐明该机制并推动其临床应用。