山柰酚通过调控IDH3B/CCAR2/IKBKB轴缓解干眼病的机制研究
一、 主要作者、机构及发表信息 本研究由张舒燕（Shuyan Zhang）1-3、沙永屹（Yongyi Sha）1、谢允（Yun Xie）1和洪佳旭（Jiaxu Hong）4-7共同完成。作者单位包括：1. 上海市闵行区中西医结合医院眼科；2. 上海中医药大学附属龙华医院眼科；3. 江苏省中医院眼科；4. 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科、脑功能与疾病全国重点实验室；5. 国家卫生健康委员会近视眼重点实验室；6. 上海市罕见病基因编辑与细胞治疗重点实验室、上海市合成免疫学工程技术研究中心；7. 复旦大学附属儿科医院眼科、国家儿童医学中心。 该研究于2025年9月22日发表在《Investigative Ophthalmology & Visual Science》（IOVS）期刊，卷66，期12，文章号50。
二、 学术背景与研究目的 本研究属于眼科学、分子生物学和药理学交叉领域。干眼病（Dry Eye Disease, DED）是一种以泪膜不稳定和高渗透压为特征的多因素眼表疾病，严重影响患者生活质量。其病理生理学涉及炎症与氧化应激的复杂相互作用。当前主流治疗方法，如人工泪液、抗炎药（如环孢素A）、免疫抑制剂等，存在疗效有限、副作用或成本高昂等问题。因此，寻找安全有效的新型治疗药物至关重要。
山柰酚（Kaempferol, Kae）是一种天然黄酮类化合物，具有已知的抗氧化、抗炎、抗癌和抗菌特性，在神经退行性疾病、心血管疾病等领域显示出治疗潜力。近年来研究表明，山柰酚对年龄相关性黄斑变性（AMD）等视网膜疾病具有保护作用。然而，山柰酚在干眼病中的作用及其精确的分子机制尚不清楚。
基于此，本研究旨在：1. 评估山柰酚在干眼病模型中的治疗效果；2. 通过整合蛋白质组学、分子对接和体内外实验验证，揭示山柰酚治疗干眼病的新机制，特别是探索其是否通过调控IDH3B/CCAR2/IKBKB轴发挥作用。
三、 详细研究流程 本研究采用了一种整合策略，结合临床蛋白质组学、计算药理学和实验验证，流程严谨且多层次。
流程一：临床样本蛋白质组学分析与关键靶点筛选 1. 研究对象与样本收集：收集了5名干眼病患者和5名正常对照者的泪液样本。所有患者在取样前24小时禁止使用人工泪液。使用Schirmer试纸收集泪液，并立即储存于-80°C。 2. 蛋白质组学分析：采用数据非依赖性采集（Data-Independent Acquisition, DIA）定量蛋白质组学技术。提取泪液总蛋白，进行胰蛋白酶消化、肽段脱盐，然后进行液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。 3. 数据分析与靶点筛选： * 差异蛋白鉴定：通过严格的标准（独特肽段≥1，有效值数量≥2等）筛选可靠蛋白质。共鉴定出3125个（DED组）和2908个（对照组）蛋白质。主成分分析（PCA）显示两组样本明显分离。共发现402个上调蛋白和197个下调蛋白。 * 功能富集分析：对差异表达蛋白进行基因本体（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析。GO分析显示，差异蛋白显著富集于“三羧酸循环（Tricarboxylic Acid Cycle）”、“细胞周期（Cell Cycle）”、“脂质代谢过程负调控”等生物过程。KEGG分析显示，差异蛋白与“柠檬酸循环（Citrate Cycle）”、“氧化磷酸化（Oxidative Phosphorylation）”、“凋亡（Apoptosis）”等通路密切相关。 * 核心靶点关联与筛选：将GO和KEGG富集分析（前10位）得到的差异蛋白（共83个）与关键的临床表型参数（泪膜破裂时间BUT、泪液分泌量TS、泪河高度TMH）进行关联分析。通过统计显著性（p < 0.05）筛选出7个潜在核心靶点蛋白：CSNK1A1、GNAI1、APPL1、IDH3B、CCAR2、IKBKB和CXADR。 4. 分子对接验证：从PDB数据库获取IDH3B、CCAR2、IKBKB等7个蛋白的三维结构，从PubChem数据库获取山柰酚的3D结构。使用AutoDock Vina进行分子对接模拟。结果显示，山柰酚与IKBKB、IDH3B和CCAR2的结合能最低（分别为-7.3、-8.1和-7.6 kcal/mol），表明结合亲和力最高。因此，选择IDH3B、CCAR2和IKBKB进行后续实验验证。
流程二：体内实验——山柰酚在干眼小鼠模型中的疗效评估 1. 动物模型建立与分组：使用8周龄雌性C57BL/6小鼠，通过每日两次滴加0.2%苯扎氯铵（Benzalkonium Chloride, BAC）溶液持续两周，诱导干眼模型。小鼠随机分为5组（每组6只）：正常对照组、模型组、阳性对照组（0.05%环孢素A滴眼液）、低剂量山柰酚组（25 mg/kg，口服灌胃）和高剂量山柰酚组（75 mg/kg，口服灌胃）。治疗持续四周。 2. 疗效评估指标与方法： * 眼表评估：治疗结束后，测量泪液分泌量（酚红棉线试验）、泪膜破裂时间（Fluorescein Break-Up Time, BUT）并进行角膜荧光素染色评分，评估眼表损伤。 * 组织病理学分析：取眼球进行石蜡包埋切片。 * 苏木精-伊红（H&E）染色：观察角膜上皮形态和厚度。 * 过碘酸希夫（Periodic Acid-Schiff, PAS）染色：评估结膜杯状细胞密度。 * 生化与分子检测： * 酶联免疫吸附试验（ELISA）：检测血清中炎症因子IL-1β和凋亡标志物Caspase-3的水平，以及细胞能量代谢产物ATP的水平。 * TUNEL染色：检测角膜组织中的细胞凋亡情况。 * 免疫荧光（IF）：检测角膜组织中IDH3B和CCAR2的蛋白表达与定位。 * 蛋白质印迹（Western Blot）和实时定量PCR（RT-qPCR）：检测角膜组织中IDH3B、CCAR2和IKBKB在蛋白和mRNA水平的表达变化。
流程三：体外实验——山柰酚对氧化应激损伤的人角膜上皮细胞的保护作用及机制验证 1. 细胞模型建立：使用人工转化的人角膜上皮细胞（Human Corneal Epithelial-Transformed, HCE-T）。用不同浓度的过氧化氢（H₂O₂）处理细胞24小时，建立氧化应激模型。通过细胞计数试剂盒-8（CCK-8）测定细胞活力，确定将细胞活力降至约50%的H₂O₂浓度（600 μM）用于后续实验。 2. 药物处理与细胞活力检测：用不同浓度山柰酚（0-80 μM）处理HCE-T细胞24小时，评估其细胞毒性。确定安全浓度范围后，用安全浓度的山柰酚（10, 20, 40 μM）与H₂O₂共处理细胞，评估山柰酚对氧化应激损伤的保护作用。 3. 机制验证：在HCE-T细胞模型中，使用Western Blot和RT-qPCR技术，检测山柰酚处理后IDH3B、CCAR2和IKBKB的蛋白及mRNA表达水平变化。 4. 数据分析：所有数据使用GraphPad Prism软件进行统计分析，多组比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），以p < 0.05为具有统计学显著性。
四、 主要研究结果 结果一：蛋白质组学与分子对接确定了山柰酚作用的核心靶点通路。 泪液蛋白质组学分析成功揭示了干眼病患者与正常人在蛋白质表达谱上的显著差异。功能富集分析将干眼病的病理机制指向了能量代谢（三羧酸循环、氧化磷酸化）、细胞周期调控和细胞凋亡等关键生物学过程。通过关联临床表型，筛选出7个核心候选蛋白。进一步的分子对接模拟表明，山柰酚与IDH3B、CCAR2和IKBKB这三个蛋白具有最强的结合亲和力。这为后续研究山柰酚通过调控IDH3B/CCAR2/IKBKB轴发挥作用的假说提供了计算生物学依据。
结果二：山柰酚有效改善了BAC诱导的干眼小鼠模型的眼表症状和组织损伤。 与模型组相比，口服高剂量山柰酚（75 mg/kg）能显著： * 改善眼表指标：增加泪液分泌量，延长泪膜破裂时间，降低角膜荧光素染色评分。 * 修复组织病理损伤：H&E染色显示，高剂量山柰酚能增加角膜上皮厚度，改善上皮细胞排列紊乱。PAS染色显示，能显著增加结膜杯状细胞的密度。 * 减轻炎症与细胞凋亡：ELISA检测显示，高剂量山柰酚能降低血清中促炎因子IL-1β和凋亡执行蛋白Caspase-3的水平，同时提升能量分子ATP的水平。TUNEL染色直接证实，山柰酚能显著减少角膜组织中的凋亡细胞数量。 这些结果综合表明，山柰酚能够从改善泪液分泌、稳定泪膜、修复眼表上皮、减轻炎症和抑制凋亡等多个层面缓解干眼症状，其疗效与阳性药环孢素A相当，甚至在某些指标（如凋亡细胞减少）上更优。低剂量山柰酚（25 mg/kg）效果有限。
结果三：山柰酚保护HCE-T细胞免受H₂O₂诱导的氧化应激损伤。 体外实验表明，600 μM H₂O₂处理可显著降低HCE-T细胞活力至约50%。浓度低于40 μM的山柰酚对细胞无毒性。当用山柰酚（20和40 μM）与H₂O₂共处理时，能有效逆转H₂O₂引起的细胞活力下降，表明山柰酚对氧化应激诱导的角膜上皮细胞损伤具有直接的保护作用。
结果四：山柰酚通过调控IDH3B/CCAR2/IKBKB轴发挥治疗作用。 这是本研究揭示的核心分子机制。 * 在体内模型中：Western Blot、RT-qPCR和免疫荧光结果显示，在干眼模型小鼠的角膜组织中，IDH3B和CCAR2的表达显著下调，而IKBKB的表达显著上调。经高剂量山柰酚或环孢素A治疗后，IDH3B和CCAR2的表达被显著上调，而IKBKB的表达被显著下调。低剂量山柰酚无此调节作用。 * 在体外细胞模型中：得到了完全一致的结果。在H₂O₂损伤的HCE-T细胞中，IDH3B和CCAR2表达下降，IKBKB表达上升。山柰酚处理能剂量依赖性地逆转这种异常表达。 * 机制解释： * IDH3B：是三羧酸循环中的关键酶，参与细胞能量代谢和氧化还原平衡。其表达上调可能有助于恢复干眼状态下受损的细胞能量代谢，对抗氧化应激。 * CCAR2：是一种参与细胞周期调控和凋亡的转录共激活因子。其表达上调可能有助于维持细胞稳态，抑制过度凋亡。 * IKBKB：是核因子κB（NF-κB）信号通路的关键激酶，促进炎症因子表达。其表达下调意味着山柰酚抑制了NF-κB介导的炎症通路。 综合来看，山柰酚通过“上修IDH3B和CCAR2，下修IKBKB”，协同作用于能量代谢-细胞周期/凋亡-炎症这三个相互关联的环节，从而打破干眼病的恶性循环。
五、 研究结论与价值 本研究得出结论：山柰酚是一种具有潜力的干眼病治疗候选药物。它通过多靶点作用，有效改善干眼模型的泪膜稳定性、减轻眼表损伤、抑制炎症和细胞凋亡。其核心分子机制在于调控IDH3B/CCAR2/IKBKB信号轴。
科学价值： 1. 揭示了干眼病的新机制：首次将IDH3B（能量代谢）、CCAR2（细胞周期/凋亡）和IKBKB（炎症）联系起来，形成了一个整合代谢、细胞稳态和炎症的干眼病病理新视角。这深化了对干眼病，特别是其背后细胞代谢异常与炎症、凋亡交互作用的理解。 2. 拓展了山柰酚的药理作用：首次系统阐述了山柰酚治疗干眼病的疗效和具体分子靶点，为其从传统抗氧化/抗炎药物向针对特定通路的多功能眼病治疗剂的转化提供了扎实的实验依据。 3. 提供了新的治疗靶点：IDH3B/CCAR2/IKBKB轴本身可作为未来开发干眼病新药的潜在靶标群。
应用价值： 为开发基于山柰酚或其衍生物的新型干眼治疗药物（可能为口服制剂或经改良后的局部眼用制剂）奠定了临床前研究基础。鉴于山柰酚是天然产物，其安全性可能优于部分现有药物，具有较好的转化前景。
六、 研究亮点 1. 研究策略新颖：采用了“临床蛋白质组学发现→计算模拟筛选→体内外实验验证”的整合研究范式，从临床问题出发，最终回归机制阐释，逻辑链条完整且说服力强。 2. 机制发现具有创新性：首次提出并验证了山柰酚通过调控“IDH3B/CCAR2/IKBKB轴”治疗干眼病，该轴串联了此前在干眼病中未被充分重视的细胞能量代谢和细胞周期调控与经典的炎症通路，为理解干眼病的复杂网络提供了新框架。 3. 研究内容系统全面：从整体动物水平的表型改善（泪液、眼表、组织病理），到细胞水平的保护作用，再到分子水平的机制挖掘（蛋白、基因表达），层层深入，证据充分。 4. 对照设置合理：设置了正常对照、疾病模型、阳性药物（环孢素A）对照以及山柰酚不同剂量组，使得疗效和机制评价更具可比性和可靠性。
七、 其他有价值的内容 1. 对现有干眼病治疗局限性的清晰阐述：文章在引言部分客观分析了人工泪液、环孢素A、皮质类固醇等现有疗法的优缺点，突出了本研究的临床需求导向。 2. 对BAC干眼模型适用性的讨论：在讨论部分，作者承认BAC模型主要通过炎症和上皮毒性起作用，但其病理变化与部分临床干眼患者（如长期使用含防腐剂眼药水者）高度相关，因此用于评估山柰酚的抗炎和细胞保护作用是合适且具有临床相关性的。这体现了作者对实验模型局限性的审慎思考。 3. 对未来研究的展望：作者明确指出本研究的局限性，如采用口服给药而非眼表局部给药，并提出了未来的研究方向，包括开发提高山柰酚溶解度和角膜渗透性的新型递送系统（如纳米载体），以及需要在更多类型的干眼模型和临床试验中进行验证。这为后续研究指明了方向。
本研究是一项设计严谨、数据翔实、机制新颖的转化医学研究，不仅为山柰酚治疗干眼病提供了强有力的证据，也为深入理解干眼病的发病机制和开发新的多靶点治疗策略做出了重要贡献。