这是一项关于中药复方制剂“肾康注射液”（Shenkang Injection, SKI）治疗糖尿病肾脏疾病（Diabetic Kidney Disease, DKD）的原创性研究。该研究由北京中医药大学中医学院的刘云华、王思彤、金鸽、高坤、王舒月、张新江、周凯东、蔡艳墨、周欣及赵宗江等人共同完成，通讯作者为赵宗江。该论文于2023年6月10日在线发表于《Phytomedicine》期刊第118卷，文献编号为154915。

该研究属于中药药理学与肾脏病学交叉领域。糖尿病肾脏疾病是糖尿病常见且严重的微血管并发症，在2型糖尿病人群中患病率约为20%至40%，并已成为终末期肾病的重要病因之一。目前现代医学对DKD的治疗主要集中于降糖、降压、降脂及抗炎等对症处理，尚缺乏特异性治疗药物。中医在DKD的个体化辨证论治方面应用广泛，但其作用机制仍需深入阐明。肾康注射液是由大黄、红花、黄芪和丹参四味中药提取物制成的中药注射剂，临床上已用于慢性肾衰竭的治疗，并在DKD患者中显示出降低尿蛋白、保护肾功能的作用。然而，其改善DKD的具体分子机制，尤其是与氧化应激相关的信号通路调控机制尚不明确。因此，本研究旨在通过网络药理学预测及体内、体外实验验证，探讨SKI对DKD大鼠肾脏的保护作用及其对Keap1/Nrf2/HO-1信号通路介导的氧化应激的调控机制。

本研究的整体工作流程主要包括三个部分：网络药理学预测、体内动物实验和体外细胞实验。首先，在网络药理学研究中，研究者通过TCMSP数据库筛选SKI中四种中药的活性成分及其作用靶点，共获得280个SKI靶点；同时从GeneCards、OMIM、DrugBank、TTD和DisGeNET五个疾病数据库中检索DKD相关疾病靶点，共获得1197个靶点。两者取交集后得到118个共同靶点。随后对这些共同靶点进行PPI蛋白互作网络分析，发现核心靶点包括NOS3、PTGS2、CASP3、CCL2、CXCL8、HIF1A、AKT1等。“药物-成分-疾病-靶点”网络分析显示槲皮素、山柰酚和木犀草素可能是SKI治疗DKD的核心活性成分。GO分析表明这些靶点主要参与激素反应、脂多糖反应、氧水平反应和炎症反应等生物学过程；KEGG通路富集分析提示SKI的作用机制可能与AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、HIF-1信号通路、活性氧物种、NF-κB信号通路等密切相关。结合文献研究，研究者提出假设：SKI可能通过影响氧化还原相关信号通路来调节AGEs诱导的氧化应激，从而延缓DKD肾损伤，并选择经典的Keap1/Nrf2/HO-1信号通路进行实验验证。

在体内动物实验中，研究者采用高糖高脂饮食喂养8周后一次性腹腔注射链脲佐菌素（35 mg/kg）的方法构建DKD大鼠模型。总共40只SPF级雄性SD大鼠随机分为对照组10只和模型组30只。模型建立过程中6只大鼠死亡并排除，剩余的24只随机分为模型验证组、厄贝沙坦组（每日25 mg/kg）和SKI组（每日5 ml/kg），每组8只。对照组和模型验证组给予等体积去离子水灌胃。干预持续16周。研究者在实验过程中观察大鼠的一般状态，每4周测量体重并收集24小时尿液进行尿蛋白定量。干预结束后采集血清检测尿素、血肌酐、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白及氧化应激指标（ROS、NO、SOD）。肾组织进行HE染色和Mallory染色观察病理形态，透射电镜观察超微结构变化。同时检测肾组织中脂质过氧化指标（LPO、MDA）和铁离子浓度。免疫组织化学和RT-PCR分别检测肾组织中Keap1、Nrf2、HO-1和GPX4蛋白及mRNA的表达。

体外细胞实验使用人肾近端小管上皮细胞HK-2，分为对照组、AGEs组（200 μg/ml）和AGEs+SKI组。首先通过CCK-8实验筛选SKI的最佳干预浓度，结果显示1%、2%和4%浓度的SKI能提高HK-2细胞活性，而更高浓度则表现出细胞毒性，因此选择4%浓度进行后续实验。细胞培养48小时后，采用CCK-8检测细胞活性，DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS水平，免疫荧光检测GPX4蛋白表达，Western blot检测Keap1、Nrf2、HO-1和GPX4蛋白表达。

网络药理学结果显示SKI可能通过影响氧化还原相关信号通路、减轻AGEs诱导的氧化应激来延缓DKD肾损伤。体内实验结果与模型验证组相比，SKI组大鼠一般状态改善，24小时尿蛋白水平显著降低，血清肌酐显著下降，尿素呈现下降趋势，总胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白水平显著降低。氧化应激方面，SKI组血清ROS水平显著降低，血清NO水平升高，SOD有升高趋势；肾组织中LPO、MDA和铁离子水平显著降低。HE和Mallory染色显示SKI组肾间质纤维化显著改善，肾小球硬化和肾小管间质纤维化减轻；电镜显示足细胞足突融合和基底膜增厚等病理改变得到缓解。免疫组织化学和RT-PCR结果显示，SKI组肾组织中Keap1蛋白和mRNA表达下降，Nrf2、HO-1和GPX4蛋白及mRNA表达显著增加。在细胞实验中，200 μg/ml AGEs刺激48小时后，HK-2细胞活性显著下降，细胞内ROS水平显著升高；SKI干预后细胞活性显著增加，ROS水平显著降低。SKI还能显著增加AGEs损伤HK-2细胞中Nrf2、HO-1和GPX4蛋白的表达，并降低Keap1蛋白的表达。值得注意的是，虽然厄贝沙坦也能改善DKD大鼠的一般状态和24小时尿蛋白水平，但其对Keap1/Nrf2/HO-1信号通路的影响不如SKI明显。

本研究的结论是：SKI能够保护DKD大鼠肾功能、延缓DKD进展，抑制AGEs诱导的HK-2细胞氧化应激损伤，其改善DKD的机制可能是通过激活Keap1/Nrf2/HO-1信号转导通路，增加下游抗氧化酶如GPX4的表达，促进机体抗氧化系统的活化来实现的。该研究为SKI在DKD治疗中的临床应用提供了科学依据，也为中药复方治疗DKD的机制研究提供了新思路。其科学价值在于将网络药理学预测与体内、体外实验验证相结合，系统阐明了SKI抗氧化应激的分子机制；其应用价值在于为DKD的中医药治疗提供了明确的靶点依据和实验证据。

本研究的亮点包括：第一，采用网络药理学预测与实验验证相结合的研究策略，从整体到局部、从预测到验证，研究设计系统且逻辑严密；第二，首次较为系统地探讨了SKI通过调控Keap1/Nrf2/HO-1信号通路改善DKD氧化应激损伤的机制；第三，同时从动物整体水平和细胞分子水平多个层次验证了SKI的肾保护作用，证据较为充分。此外，作者还在讨论部分指出了一些研究不足，例如动物实验中未设置SKI不同剂量组进行比较，未来可进一步研究SKI中核心单体化合物的作用机制，以及利用纳米技术等新方法提高中药成分的生物利用度等。论文还提供了SKI中主要活性成分的列表和PCR引物序列，为后续相关研究提供了参考。