本研究成果由来自以色列和泰国的跨机构研究团队共同完成。主要作者包括Modi Ropin（SynVaccine有限公司和特拉维夫大学生物医学工程系）、Zohar Zafrir（特拉维夫大学生物医学工程系）、Bunpote Siridechadilok和Amporn Suphatrakul（泰国国家遗传工程与生物技术中心）以及Justin Julander（犹他州立大学抗病毒研究所）。通讯作者为Tamir Tuller教授（特拉维夫大学生物医学工程系）。该研究于2025年1月11日以开放获取形式提前在线发表于《Nucleic Acids Research》期刊（2025年第53卷，文章编号gkae1313）。
本研究属于合成生物学与生物工程交叉领域，聚焦于黄病毒科（Flaviviridae）成员寨卡病毒（Zika virus, ZIKV）的疫苗开发。寨卡病毒是一种单股正链RNA病毒，主要通过伊蚊传播，可导致胎儿小头畸形等严重先天缺陷。尽管全球范围内已开展多项疫苗研发工作，但截至目前尚未有任何寨卡病毒疫苗获得批准，特别是缺乏安全有效的减毒活疫苗（Live-attenuated vaccine, LAV）。
传统减毒活疫苗的开发依赖于病毒在非自然宿主中的连续传代培养，这种经验性方法存在两大缺陷：一是无法精确控制减毒程度，二是可能导致病毒基因组不稳定性增加，从而产生毒力回复突变的风险。本研究提出了一种全新的计算生物学解决方案，通过理性设计引入同义突变（silent mutation）来精准调控病毒的减毒表型。
研究团队基于两个关键科学假设：第一，RNA局部折叠能（local RNA folding energy）的进化保守性与病毒基因功能密切相关；第二，适度改变这些保守特征可精细调控病毒毒力。该研究首次开发了整合RNA二级结构选择压力和序列进化保守性分析的计算管道，为病毒疫苗的理性设计提供了创新方法论。
研究团队从VIPR病毒病原体资源库和NCBI GenBank下载了540株寨卡病毒完整基因组序列。经过去重和质量控制后，最终保留了333株具有完整注释的代表性毒株，这些毒株涵盖了寨卡病毒的全球遗传多样性。使用Clustal Omega多序列比对工具（MSA）进行基于氨基酸序列的比对，并将结果映射回核苷酸水平。
为评估RNA二级结构选择压力的统计显著性，研究团队开发了四种不同的零模型： 1. 垂直密码子使用偏倚模型（VCUB）：保持MSA各列的密码子频率和氨基酸不变，进行同义密码子置换 2. 列置换模型（col_perm）：随机交换MSA中的同义密码子列 3. 二核苷酸随机化模型：保持氨基酸顺序和相邻核苷酸对频率分布 4. 同义密码子随机化模型：保持GC含量和密码子频率
每种序列生成1000个随机化版本，通过计算z-score来评估实际观测值的统计显著性。
基于RNA局部折叠能（LFE）选择分析，识别出在ns5蛋白编码区存在七个具有显著选择压力的RNA结构簇（p<0.05，|z-score|>2）。研究团队开发了基于模拟退火的RNA优化程序，在不改变氨基酸序列的前提下，设计了两组减毒变体： - fold_104变体：在7个RNA结构簇中引入104个同义突变，使局部折叠能改变达到最大可能改变的50% - fold_104_169变体：在fold_104基础上，额外增加65个位于五个附加结构簇的同义突变（p=0.07）
使用RNAentropy软件证实这些改变显著影响RNA结构构象熵（structural entropy），与自由能变化高度相关（r=0.98）。
基于333株寨卡病毒的多序列比对，计算每个位点的香农熵（Shannon entropy）和保守性评分。设计算法选择中等熵值（0.2<熵值<1.5）的位点进行同义突变替换，新密码子需满足： 1. 与原始密码子同义 2. 在对应MSA列中的频率低于原始密码子 3. 相对频率>15%（避免使用罕见密码子）
据此开发了两组变体： - high_ent_75_76：在高熵区（0.36<熵值<1.5）引入75个同义突变 - med_ent_75_78：在中等熵区（0.2<熵值<0.36）引入75个同义突变
最终通过组合策略得到两个综合变体：fold_104_169_hi_ent_75_76和fold_104_169_med_ent_75_78。
使用Vero细胞（ATCC CRL-1587）进行病毒培养和传代，在MEM培养基（含10%胎牛血清）中维持。所有减毒病毒株均源自泰国寨卡病毒分离株ZIKV SV0010的感染性克隆。
通过吉布森组装法将修饰后的ns5基因片段与病毒基因组其他部分（5’UTR-E、ns1-ns4b和3’UTR）重组，转染BHKl21-rtta3细胞拯救病毒。第一代病毒在Vero细胞中扩增，并通过以下方法表征： - 病灶形成试验：使用抗E蛋白单克隆抗体4G2进行免疫染色，定量感染性病毒颗粒 - 多步生长曲线：感染复数（MOI）=0.01条件下，监测0-6天内的病毒复制动力学 - 细胞病变效应观察：记录感染细胞的形态学变化和死亡进程
选用AG129小鼠（干扰素α/β和γ受体缺陷型）作为寨卡病毒感染模型。每组10只小鼠（雌雄各半），随机分为实验组和对照组。
疫苗接种方案： - 疫苗组：分别接种10^2或10^3 ffu的各减毒病毒株（野生型合成病毒、104_169、med_ent和hi_ent变体） - 对照组：接种PBS或正常对照 接种后28天，用马来西亚寨卡病毒株（P6-740）进行攻毒（~100 CCID50皮下注射）
监测指标： 1. 生存分析：记录疫苗接种期和攻毒后的存活率 2. 体重变化：每日记录体重变化百分比 3. 血清学检测： - 中和抗体：疫苗接种后14天和攻毒前，用空斑减少中和试验（PRNT50）测定 - 病毒载量：攻毒后3天和7天，通过qRT-PCR定量血清病毒RNA 4. 临床症状评分：记录包括嗜睡、肢体无力等六类症状
RNA二级结构分析显示，寨卡病毒结构蛋白（特别是囊膜蛋白）编码区存在强烈的RNA折叠选择压力。ns5蛋白中鉴定的12个保守结构簇经过同义突变修饰后，rnaentropy分析证实结构熵发生了预期方向的改变（补充表S1）。进化保守性分析发现结构蛋白区域的熵值普遍较低，但在261个密码子位点检测到中等可变性。
病毒复制动力学分析显示： - fold_104和fold_104_169变体在Vero细胞中形成的病灶显著小于野生型（p<0.05），但病毒产量无统计学差异 - 加入保守性修饰的med_ent和hi_ent变体表现出更明显的减毒表型： - 细胞病变延迟：野生型病毒4天导致完全细胞死亡，fold_104_169变体4-5天，而med/hi变体6天后仍未见完全死亡 - 持续性复制：med/hi变体维持病毒复制的时间显著长于野生型（p<0.01）
疫苗接种阶段： - 野生型合成病毒接种组22天内全部死亡 - 104_169变体在10^3 ffu剂量下死亡率90%，10^2 ffu剂量下存活20% - med/hi变体表现最佳：10^2 ffu剂量下无死亡，10^3 ffu剂量下仅10%死亡率
攻毒保护效果： - 未接种组攻毒后全部死亡 - med/hi变体疫苗接种组保护率达80-90% - 中和抗体水平：所有存活小鼠平均PRNT50滴度约3 log10 - 病毒载量：med变体接种组攻毒后3天的病毒RNA显著低于对照组（p<0.05）
临床症状与体重变化： - med/hi变体接种组体重下降幅度显著小于野生型接种组（p<0.01） - 疫苗接种后13天起体重开始恢复 - 疾病症状评分显示med/hi变体引起的临床症状较轻微
本研究建立了首个整合RNA结构预测与进化保守性分析的计算疫苗设计管道，其创新性体现在： 1. 开发了多层次的零模型系统，可可靠识别RNA功能结构域 2. 实现了通过同义突变精细调控病毒减毒程度 3. 证明了局部RNA折叠能和序列保守性的协同优化可产生稳定减毒表型
两种优选减毒株（fold_104_169_med_ent_75_78和fold_104_169_hi_ent_75_76）展现出良好的临床转化潜力： - 安全性：在高度敏感的AG129模型中实现90%存活率 - 免疫原性：诱导产生高滴度中和抗体（PRNT50≈1:1000） - 保护效率：对野生型病毒攻击提供80-90%保护
该研究提出的”理性减毒”策略具有平台特性，可扩展到其他RNA病毒疫苗开发中。特别是在应对新发传染病时，这种基于计算预测的快速疫苗设计方法可显著缩短研发周期。研究者特别强调，该方法可与已有的其他减毒策略（如密码子去优化）联合使用，实现更精准的毒力调控。
多尺度计算模型创新：整合RNA结构预测、进化保守性分析和密码子使用偏倚，建立了多维度的减毒位点识别系统。
疫苗设计策略突破：首次证明适度改变中等保守区域（而非高度保守区）可平衡减毒效果与免疫原性。
实验验证体系完善：从分子（RNA结构）、细胞（复制动力学）到整体动物（免疫保护）三个层面提供了严谨的证据链。
转化应用价值显著：在严格的AG129模型中，优选减毒株实现了临床疫苗所需的安全性和有效性平衡。
研究团队指出，虽然AG129模型是寨卡病毒研究的金标准，但其高度敏感性可能导致对人类疫苗效果的过度保守估计。未来需要在非人灵长类模型中进行验证，并开展以下方向研究：
这项研究为RNA病毒疫苗开发提供了新的方法论框架，其”理性设计”理念有望变革传统经验式减毒疫苗的研发模式。特别是在应对未来新发病毒疫情时，这种基于计算生物学的快速应对策略将显示独特优势。