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双引导RNA介导的Twin Prime Editing技术实现大片段DNA的精准编辑

作者及机构
本研究由Andrew V. Anzalone、Xin D. Gao、Christopher J. Podracky等共同完成，通讯作者为David R. Liu。研究团队来自美国哈佛大学和麻省理工学院Broad研究所的Merkin医疗转化技术研究所、哈佛大学化学与化学生物学系，以及霍华德·休斯医学研究所（HHMI）。研究成果于2022年5月发表于《Nature Biotechnology》期刊（DOI:10.1038/s41587-021-01133-w）。

学术背景
人类疾病相关的遗传变异范围广泛，从单碱基突变到数百万碱基的缺失或重排均可能致病。传统CRISPR-Cas9基因编辑技术依赖DNA双链断裂（DSBs, double-strand breaks），易导致不可控的插入/缺失（indels）或染色体异常。尽管碱基编辑器（base editors）和初代Prime Editor（PE）能实现无DSBs的精准编辑，但其编辑范围局限于短片段（≤80 bp）。本研究旨在开发一种名为Twin Prime Editing（TwinPE）的新技术，通过双引导RNA（pegRNAs）协同作用，实现大片段DNA的精准删除、替换、整合及倒位，为复杂遗传疾病的治疗提供新工具。

研究流程与方法
1. TwinPE系统设计
- 原理：TwinPE利用两个pegRNAs分别靶向DNA双链，通过Prime Editor蛋白（含Cas9切口酶和逆转录酶）在两条链上合成互补的3’ DNA flaps。这些flaps通过杂交替换目标区间的内源序列，无需依赖同源重组或DSBs（图1a）。
- 验证实验：在HEK293T细胞的HEK3位点，研究者用TwinPE将90 bp内源序列替换为38 bp的Bxb1整合酶attB位点，效率高达80%（图1c）。通过调整pegRNA的逆转录模板（RT模板）重叠长度（22-38 bp），证明部分重叠即可实现全长序列插入。

1. 大片段编辑能力测试

   • 插入效率：在CCR5位点，TwinPE插入108 bp的FKBP12 cDNA片段效率达16%，较PE3系统提升20倍（图2b）。
     
   • 外显子重编码：针对苯丙酮尿症（PKU）相关基因PAH的多个外显子，TwinPE成功实现46-64 bp的序列重编码，效率最高达27%（图2c）。
     
   • 删除策略优化：比较单锚定（SA）、混合锚定（HA）及Primedel（PD）三种删除策略，发现PD策略在HEK3位点删除90 bp的效率最高（40%），且indels仅1.6%（图2e）。在杜氏肌营养不良症（DMD）基因中，TwinPE删除780 bp的 exon 51效率达28%，indels仅5.1%，远低于Cas9核酸酶的45%（图2f）。

2. 与重组酶联用的基因整合与倒位

   • 安全港位点标记：在CCR5和AAVS1位点，TwinPE插入Bxb1的attB/attP序列效率超50%（图3b-c）。
     
   • 质粒整合：通过单次转染将TwinPE与Bxb1重组酶联用，在HEK293T细胞中实现5.6 kb供体质粒的靶向整合，效率达6.8%（图3d）。优化显示，缩短pegRNA的flap重叠可减少质粒间重组，提升整合效率（图3e）。
     
   • 治疗性基因表达：在Huh7肝细胞中，通过TwinPE在ALB基因内含子1插入attB位点，并整合人凝血因子IX（hFIX）cDNA，成功检测到hFIX分泌（扩展数据图7）。
     

3. 大片段倒位矫正

   • Hunter综合征模型：针对IDS基因与假基因IDS2间40 kb的致病性倒位，TwinPE在两端插入反向的attB/attP位点，经Bxb1介导实现倒位矫正。测序证实attr和attl重组产物纯度≥80%，单步RNA转染效率达2.6%（图4d-e）。

主要结果与逻辑关联
- 编辑灵活性：TwinPE通过调整pegRNA设计，可灵活选择删除、替换或插入的边界，克服了传统核酸酶对PAM序列的依赖（图2d）。
- 效率与安全性：在DMD基因编辑中，TwinPE的indels仅为Cas9的1/9，且脱靶编辑未检出（补充表5）。
- 协同重组酶的优势：Bxb1介导的整合与倒位避免了DSBs导致的染色体异常，为临床转化提供安全路径。

结论与价值
TwinPE首次实现了无DSBs的大片段DNA精准编辑，其科学价值体现在：
1. 技术突破：将Prime Editing的编辑范围从数十bp扩展至数千bp，填补了碱基编辑与重组酶技术间的空白。
2. 治疗潜力：可一次性矫正基因中多个致病突变，或通过外显子删除/倒位恢复阅读框，为PKU、DMD等疾病提供新策略。
3. 工具拓展：与Bxb1等重组酶联用，支持基因治疗载体的定点整合和复杂结构变异修复。

研究亮点
1. 创新性设计：双pegRNA协同作用避免依赖同源重组，且RT模板无需编码全长插入序列。
2. 高效低毒性：在HEK293T、Huh7等多种细胞中验证高效性，且无显著脱靶效应。
3. 多场景应用：涵盖从短片段替换到40 kb倒位的多种编辑需求，适配不同疾病模型。

其他价值
研究者开发了含evopreQ1模体的工程化pegRNA（epegRNA），可进一步提升编辑效率1.5-2.5倍（图2e）。此外，通过UMI（unique molecular identifiers）标记和ddPCR（droplet digital PCR）定量，确保了数据可靠性（方法部分）。

该报告完整呈现了研究的创新性、方法学细节及临床转化潜力，符合学术传播的规范要求。