自然生物技术领域突破性进展：基于Tada-8e进化的小型高效胞嘧啶碱基编辑器开发研究

作者团队及发表信息： 本研究由哈佛大学Broad研究所的Monica E. Neugebauer、Alvin Hsu等14位研究者共同完成，通讯作者为David R. Liu教授。成果于2023年5月发表在《nature biotechnology》期刊（卷41，页673-685），DOI: 10.1038/s41587-022-01533-6。

学术背景： 在基因编辑领域，胞嘧啶碱基编辑器（CBEs, cytosine base editors）与腺嘌呤碱基编辑器（ABEs, adenine base editors）是两类重要工具。虽然CBEs能实现C•G到T•A的精准转换，但存在体积过大、脱靶活性高等局限。本研究源于一个重要发现：源于大肠杆菌tRNA脱氨酶Tada进化而来的ABEs具有体积小（166个氨基酸）、脱靶率低等优势。研究团队提出科学假设：能否通过定向进化将Tada-8e改造成高效胞嘧啶脱氨酶，从而创造兼具ABEs优势和C•G编辑能力的新型编辑器？

研究方法与流程： 1. 噬菌体辅助连续进化（PACE, phage-assisted continuous evolution）系统设计： - 创新性构建两个选择回路：回路1通过非模板链编辑（C6A7A8→T6A7A8）实现宽容性初选；回路2通过模板链编辑（TGG→终止密码子）实施严格负选择 - 采用改进的PANCE（非连续进化）策略进行初始进化，后续结合159小时PACE实验 - 使用RSF1030载体系统，宿主菌含突变质粒（MP）和辅助质粒（AP），通过调控gIII基因表达实现选择压力

1. 脱氧胞苷脱氨酶进化过程：

• 起始材料：Tada-8e腺苷脱氨酶
• 四轮PANCE后，噬菌体增殖能力提升>100倍
• 关键突变集中在26-28位DNA结合残基（如R26G/E27K/V28G）
• 累计稀释倍数达10^139倍，获得五个主要变体（Tada-CDa至Tada-CDe）

1. 哺乳动物细胞验证：

• 在HEK293T细胞中测试BE4max架构下的编辑效率
• 对比组：BE4max、evoAPOBEC1-BE4max（evoA）、evoFERNY-BE4max
• 靶向9个基因组位点，转染72小时后高通量测序分析
• 建立10,638个基因组整合靶点的小鼠胚胎干细胞（mESCs）文库进行全面表征

1. 脱靶效应评估：

• 正交R-loop实验检测Cas非依赖性DNA脱靶
• RNA编辑分析靶向CTNNB1、IP90和RSL1D1转录本
• 引入V106W突变进一步降低脱靶活性

1. 治疗应用验证：

• 原代人T细胞中多重编辑CXCR4和CCR5基因
• CD34+造血干细胞和祖细胞（HSPCs）中BCL11A增强子编辑

主要发现： 1. 编辑器性能突破： - 进化获得的Tada-CDs变体展现出显著的底物选择性转变：在E. coli实验中，C•G-to-T•A编辑效率达90-97%，而A•T-to-G•C编辑仅1-3%，选择性提升>3,000倍 - HEK293T细胞中，Tada-CBEs在9个测试位点的平均峰值编辑效率（51-60%）超越传统BE4max（47%）和evoA（55%） - CRISPR冷冻电镜结构（PDB:6VPC）显示，26-28位突变位于活性位点附近loop区，改变了底物结合构象

1. 脱靶控制优势：

• 正交R-loop实验显示，Tada-CBEs的平均Cas非依赖DNA脱靶编辑（0.84-1.2%）显著低于BE4max（3.6%）
• RNA编辑分析表明，Tada-CBEs在CTNNB1等转录本中的脱靶编辑≤0.1%，而BE4max达0.7%
• V106W突变使脱靶活性再降低1.9倍，实现0.11-1.1%的DNA脱靶率

1. 编辑窗口特性：

• mESCs文库分析显示，Tada-CBEs编辑窗口（protospacer位置3-8）比BE4max（位置3-9）更精准
• 序列偏好性分析揭示5’端Y（Y=T/C）的强促进作用，与祖先ABE7.10特性相似但3’端偏好存在差异

1. 治疗应用验证：

• 原代T细胞中，Tada-CBEs在CXCR4和CCR5位点实现70%平均编辑效率，媲美BE4max（67%）
• HSPCs中BCL11A增强子编辑效率（14-23%）是传统编辑器的2-3倍
• 双编辑器Tada-DE同步实现A•T-to-G•C（80%）和C•G-to-T•A（73%）编辑

结论与价值： 该研究通过定向进化成功将腺苷脱氨酶改造为高效胞嘧啶编辑器，创造了新一代Tada-CBEs。其科学价值体现在： 1. 方法学创新：建立”双重选择回路”进化策略，实现底物特异性的根本转变 2. 工具革新：提供目前体积最小（可比ABEs）、脱靶最低的CBE方案 3. 机制发现：揭示26-28位残基在决定脱氨酶底物选择中的关键作用 临床应用潜力包括： - 单AAV载体递送：得益于166个氨基酸的小体积 - 血液病治疗：在HSPCs中高效编辑BCL11A增强子 - HIV治疗：多重编辑T细胞CCR5/CXCR4共受体

研究亮点： 1. 首次实现腺苷脱氨酶向胞嘧啶脱氨酶的功能转化 2. 开发的Tada-CD系列兼具高活性（峰值效率达60%）与高选择性（C/A编辑比26.8-47.8） 3. 全面验证跨平台兼容性（spCas9、enME2-C Cas9、saCas9） 4. 建立10,638位点的全基因组编辑谱系分析模型

特别值得关注的是，研究者发现的V106W突变可进一步缩小编辑窗口至4-5bp，为需要单碱基精度的应用提供理想工具。该研究不仅开发了新型基因编辑工具，更为脱氨酶工程提供了可推广的进化范式。