磁性核壳壳聚合物微球用于菠萝蛋白酶分离纯化的研究

作者及发表信息

本研究由Juan Han、Li Wang、Lei Wang、Chunmei Li、Yanli Mao和Yun Wang（通讯作者）合作完成，研究团队分别来自江苏大学食品与生物工程学院、化学化工学院以及绿色化学与化工技术研究所，以及河南城建学院河南省水污染控制与修复技术重点实验室。该研究发表于Food Chemistry期刊，2019年出版，卷号283，页码1-10。

学术背景

研究领域：本研究属于生物分离工程与材料科学的交叉领域，聚焦于固定化金属亲和色谱（IMAC, Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography）技术结合磁性纳米材料在蛋白质纯化中的应用。

研究动机：
菠萝蛋白酶（Bromelain）是一种具有重要商业价值的蛋白水解酶，广泛应用于食品、医药、化妆品和纺织工业。然而，传统纯化方法（如丙酮沉淀、层析步骤）存在效率低、成本高、步骤繁琐等问题。近年来，基于磁性纳米颗粒的分离技术因其快速响应、高吸附容量和可重复使用性备受关注。本研究旨在开发一种新型核壳壳结构的磁性聚合物微球（Fe₃O₄@SiO₂@P(NIPAM-co-AIM)/Ni²⁺），用于高效、高选择性分离菠萝蛋白酶。

科学问题：
1. 如何设计一种兼具高吸附容量和选择性的磁性载体？
2. 如何通过温度响应性聚合物（如PNIPAM）实现酶的动态吸附与保护？
3. 如何验证该材料在复杂生物样品（如菠萝皮粗提物）中的实际应用效果？

研究流程

1. 材料合成

步骤1：Fe₃O₄磁核制备
- 方法：溶剂热法（Solvothermal Reaction），以FeCl₃·6H₂O为铁源，NH₄Ac为还原剂，柠檬酸钠为稳定剂，在200℃下反应16小时。
- 结果：获得直径约250 nm的单分散磁性微球，透射电镜（TEM）显示其表面蓬松。

步骤2：SiO₂包覆（Fe₃O₄@SiO₂）
- 方法：溶胶-凝胶法（Sol-Gel），以TEOS（正硅酸乙酯）为硅源，通过氨水催化水解在Fe₃O₄表面形成30 nm厚的SiO₂层。
- 功能：SiO₂层增强微球分散性，并提供表面硅羟基用于后续修饰。

步骤3：聚合物壳层构建（Fe₃O₄@SiO₂@P(NIPAM-co-AIM)）
- 方法：蒸馏沉淀聚合（Distillation-Precipitation Polymerization, DPP），以N-异丙基丙烯酰胺（NIPAM）和1-烯丙基咪唑（AIM）为共聚单体，MBA为交联剂。
- 创新点：
- AIM提供咪唑基团用于螯合Ni²⁺，形成His标签蛋白结合位点。
- NIPAM赋予温度响应性，其低临界溶解温度（LCST）约32℃，可调控酶吸附与释放。

步骤4：Ni²⁺负载
- 方法：将微球浸泡于NiCl₂溶液，通过咪唑-Ni²⁺配位作用固定金属离子。

2. 材料表征

• TEM：证实核壳壳结构（Fe₃O₄核→SiO₂中间层→20 nm聚合物壳）。
  
• FT-IR：检测到咪唑基团（918 cm⁻¹）和PNIPAM特征峰（1521 cm⁻¹）。
  
• TGA：聚合物壳占总质量的45%。
  
• VSM：饱和磁化强度为19.77 emu/g，可实现30秒内快速磁分离。
  

3. 吸附性能优化

• 最佳条件：pH=7.0、30℃、吸附时间30分钟，最大吸附容量达198 mg/g。
  
• 吸附机制：Langmuir和Freundlich模型拟合表明为多层异质吸附。
  

4. 实际应用验证

• 菠萝皮粗提物纯化：
  
  • 步骤：吸附→洗涤→乙酸洗脱→咪唑溶液再生。
    
  • 结果：SDS-PAGE显示单一目标条带，纯化因子1.68，酶活性回收率80%。
    
• 热保护功能：
  
  • 80℃下，固定化酶活性保留24.7%，而游离酶完全失活。
    

5. 结构稳定性分析

• UV-Vis/CD：洗脱前后酶二级结构（α-螺旋特征峰208/222 nm）未改变。
  

主要结果与结论

1. 高效吸附：微球对菠萝蛋白酶的吸附容量（198 mg/g）优于文献报道的同类材料（如IDANi²⁵载体，103 mg/g）。
   
2. 选择性：对非His标签蛋白（如β-葡萄糖苷酶）吸附量极低。
   
3. 可重复性：6次循环后吸附容量保持95%。
   
4. 热保护机制：PNIPAM在高温下疏水化，包裹变性酶防止聚集，降温后释放复性。
   

研究价值

• 科学意义：
  
  • 提出“温度响应性聚合物+磁性分离”协同策略，为蛋白纯化提供新思路。
    
  • 首次将AIM单体用于IMAC载体设计，避免传统配体（如NTA/IDA）的合成复杂性。
    
• 应用潜力：可直接从农业废弃物（菠萝皮）中高收率提取高纯度酶，降低工业成本。
  

研究亮点

1. 材料创新：核壳壳结构兼具磁性分离、高载Ni²⁺容量和温度响应性。
   
2. 方法优势：DPP法实现聚合物壳均匀包覆，优于传统嫁接工艺。
   
3. 多功能性：同步实现分离、纯化、酶保护三重功能。
   

其他价值

• 该材料可扩展至其他His标签蛋白的纯化，如重组抗体或细胞裂解液中的目标酶。
  
• 研究数据（如TGA、VSM）为类似磁性复合材料的开发提供参考基准。