学术研究报告：USP46-POU4F1-HPSE信号轴在先天性巨结肠（Hirschsprung病）发病机制中的作用

作者与机构
本研究由山东大学齐鲁医院小儿外科的Guowei Li、Fengyin Sun、Jiawei Chen等团队完成，通讯作者为Peimin Hou和Aiwu Li。研究成果发表于2025年4月的《Acta Biochim Biophys Sin》期刊（卷57，期X，页码1-15），DOI编号10.3724/abbs.2025064。

学术背景

科学领域：本研究属于发育生物学与病理学的交叉领域，聚焦于先天性巨结肠（Hirschsprung disease, HSCR）的分子机制。HSCR是一种以远端结肠肠神经节细胞缺失为特征的先天性疾病，导致功能性肠梗阻，发病率约为1/5000，男性患者占比更高。

研究动机：尽管已知RET、EDNRB等基因突变与HSCR相关，但仅能解释约20%的散发病例，提示其他调控机制（如表观遗传或翻译后修饰）可能参与发病。团队前期发现细胞外基质（Extracellular Matrix, ECM）重塑异常与HSCR相关，但具体分子通路尚不明确。

研究目标：通过整合定量蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学，揭示HSCR中差异蛋白表达与磷酸化修饰的特征，并探索USP46（去泛素化酶）在ECM重塑和肠神经嵴细胞（Enteric Neural Crest Cells, ENCCs）迁移中的作用机制。

研究流程与方法

1. 样本收集与分组
- 研究对象：从4例HSCR患者的手术标本中获取三组组织：无神经节段（Aganglionic）、扩张段（Megacolon）及正常段（Normal），每组4例。
- 伦理审批：研究经齐鲁医院伦理委员会批准（编号QLU-2024-HSCR-007）。

2. 蛋白质组与磷酸化蛋白质组分析
- 蛋白质提取与消化：组织经SDS裂解缓冲液处理，超声破碎后，通过胰蛋白酶消化成肽段，采用DIA（数据非依赖采集）质谱技术进行定量分析。
- 磷酸化肽段富集：使用HighSelect™ Fe-NTA试剂盒富集磷酸化肽段，LC-MS/MS（液相色谱-串联质谱）检测。
- 数据分析：
- 软件：DIA-NN 1.8.1（蛋白质组）、Spectronaut v18（磷酸化组）。
- 数据库：Swiss-Prot人类蛋白质数据库（2021年6月版）。
- 显著性标准：Fold change >1.5或<0.67，p<0.05。

3. 功能验证实验
- USP46与POU4F1互作验证：
- 免疫共沉淀（Co-IP）：HEK293T细胞中证实USP46与转录因子POU4F1结合。
- GST Pull-down：验证两者直接相互作用。
- 去泛素化功能：USP46过表达降低POU4F1泛素化水平，而敲除USP46增加其泛素化降解。
- 转录调控机制：
- 染色质免疫沉淀（ChIP-qPCR）：证实POU4F1结合HPSE（Heparanase，乙酰肝素酶）启动子。
- 双荧光素酶报告实验：POU4F1过表达显著增强HPSE启动子活性。
- 细胞迁移实验：
- 划痕愈合与Transwell实验：USP46敲除减少SH-SY5Y细胞迁移能力，HPSE活性下降导致ECM降解受阻。

主要结果

1. 蛋白质组差异：

   • 无神经节段中鉴定到94个上调蛋白（如ECM成分）和140个下调蛋白（如线粒体功能相关蛋白）。KEGG分析显示氧化磷酸化通路显著抑制。
     
   • USP46下调：无神经节段中USP46表达降低70%（p<0.001），免疫组化证实其细胞质定位。
     

2. USP46-POU4F1-HPSE轴机制：

   • USP46通过去泛素化稳定POU4F1，促进其结合HPSE启动子，增强HPSE表达。
     
   • HPSE酶活性实验显示，USP46敲除导致ECM降解能力下降50%（p<0.01）。
     

3. 功能影响：

   • 细胞迁移：USP46敲除使SH-SY5Y细胞迁移减少45%（p<0.01），证实该轴调控ENCCs迁移。
     

结论与意义

科学价值：
- 首次揭示USP46通过稳定POU4F1调控HPSE表达，进而影响ECM重塑和ENCCs迁移的分子通路，为HSCR提供了新的发病机制解释。
- 提出USP46激活或HPSE靶向治疗可能改善HSCR患者术后肠道功能。

应用前景：
- 治疗靶点：USP46激动剂或基因疗法（如CRISPRa）可能恢复ENCCs迁移能力。
- 诊断标志物：USP46表达水平或可作为HSCR分型的潜在指标。

研究亮点

1. 多组学整合：结合蛋白质组与磷酸化组，系统性解析HSCR的分子特征。
   
2. 机制创新：发现USP46-POU4F1-HPSE这一全新信号轴，填补了ECM调控与神经嵴细胞迁移间的空白。
   
3. 技术优化：采用DIA质谱提高数据重现性，并通过ChIP-qPCR精准验证转录调控。
   

局限性：需在USP46条件性敲除小鼠模型中验证体内功能，并扩大临床样本验证表达异质性。

总结：本研究通过多学科技术揭示了USP46在HSCR中的核心作用，为理解肠道神经系统发育障碍提供了新视角，并为靶向治疗开发奠定基础。