本研究报告基于发表在《Biomaterials》期刊（2019年，第212卷，第115-125页）上的一篇原创研究论文。该研究由麻省理工学院生物工程系和机械工程系的Giovanni S. Offeddu、Kristina Haase、Mark R. Gillrie、Ran Li，哈佛大学分子与细胞生物学系的Olga Morozova，以及安进公司（Amgen Inc.）的Dean Hickman、Charles G. Knutson和Roger D. Kamm（共同通讯作者）合作完成。研究旨在开发并验证一种新型的体外微血管模型，用于精确测量生物大分子（如治疗性蛋白和抗体）跨越血管内皮的转运过程，特别是区分并量化跨细胞（transcellular）和细胞旁（paracellular）两种主要渗透途径。
学术背景 随着生物大分子药物（Biopharmaceuticals/Biologics），如单克隆抗体等，在治疗癌症、自身免疫性疾病等领域取得巨大成功，精确评估其在体内的分布变得至关重要。这些药物的疗效很大程度上取决于它们能否从血液循环中有效渗出并到达靶组织。血管内皮构成了药物分布的主要屏障，物质主要通过两种途径穿越内皮：一是通过内皮细胞之间的连接被动扩散（细胞旁途径），二是通过囊泡介导的主动运输（跨细胞途径，即transcytosis）。对于分子量大的生物制剂，由于尺寸限制，其通过细胞旁途径的渗透率极低，跨细胞转运成为其进入组织的主要方式。然而，当时标准的体外内皮模型（如Transwell单层细胞培养系统）存在显著缺陷：它们通常形成不连续的细胞连接，导致对大小分子的通透性都异常增高，比体内观察到的数值高出几个数量级，且难以准确模拟和区分两种转运机制。因此，开发一种能更真实模拟人体毛细血管三维结构、细胞连接复杂性和囊泡运输功能的体外模型，以提供生理相关性的渗透性数据，对于药物研发（如优化候选分子的组织分布特性）具有迫切需求。本研究的目标正是建立这样一个平台——利用微流控技术培养三维自组装的人源微血管网络（Microvascular Networks, MVNs），并以此为基础精确测量蛋白质（尤其是白蛋白和免疫球蛋白G）的跨内皮转运，并探究其分子机制，特别是新生儿Fc受体（FcRn）在其中的作用。
详细工作流程 本研究的工作流程系统而严谨，主要包括以下几个步骤：
微血管网络（MVNs）装置的构建与培养：
- 装置制造：研究使用激光切割聚甲基丙烯酸甲酯板材制作模具，并用聚二甲基硅氧烷（PDMS）翻模制成三通道微流控芯片。中央通道用于注入水凝胶和细胞，两侧通道用于灌注培养基。
- 细胞培养与MVNs自组装：将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和正常人肺成纤维细胞（NHLFs）混合于纤维蛋白凝胶前体中，注入芯片中央通道。在共培养环境下，内皮细胞经历类似血管生成的过程，在5-7天内自组装形成具有贯通管腔的三维微血管网络。为精确测量跨内皮运输（而非直接从侧通道扩散），在第4天，将额外的HUVECs接种到中央凝胶通道的两侧壁上，形成连续的内皮单层，将MVNs与侧通道完全隔开。
渗透性测量方法建立：
- 测试分子：研究使用了不同分子量（4-500 kDa）和不同电荷（中性、正电、负电）的荧光标记葡聚糖（dextran）作为模型分子，以及两种具有重要生物制药意义的蛋白质：人血清白蛋白（Albumin）和免疫球蛋白G（IgG）。
- 测量过程：将含有测试分子的培养基灌注到MVNs的管腔中。使用共聚焦显微镜定时（每12分钟）对网络进行三维成像，获取荧光信号。
- 数据分析：通过图像处理软件（ImageJ/Fiji）对血管腔和周围基质区域进行分割和三维重建。利用荧光强度与浓度成正比的假设，根据公式计算内皮对特定溶质的渗透系数（Permeability Coefficient, P）。该公式基于溶质通量、内皮表面积和跨内皮浓度差。所有测量均在极低的流体静压和渗透压下进行，以排除对流的影响，确保测量反映的是扩散和主动运输过程。
模型生理相关性验证与机制探究实验：
- 形态学与功能表征：通过成像测量MVNs的血管直径、密度和表面积，并与体内毛细血管数据对比。通过免疫荧光染色检测内皮细胞间连接蛋白（VE-cadherin, ZO-1）和糖萼（glycocalyx）的表达与分布。
- 与Transwell系统对比：在相同细胞来源（HUVECs，有/无成纤维细胞共培养）条件下，平行使用传统Transwell系统测量相同分子的渗透性，进行直接比较。
- 温度依赖性实验：将MVNs分别在生理温度（37°C）和室温（21°C）下进行渗透性测量。降低温度会抑制囊泡的胞吞和胞内运输，从而主要影响跨细胞途径。通过比较不同温度下白蛋白/IgG（主要预期为跨细胞运输）和相似尺寸葡聚糖（主要预期为细胞旁运输）的渗透性变化，来推断其主要转运机制。
- 囊泡运输机制研究：使用扫描电子显微镜（SEM）观察不同温度下内皮细胞中囊泡的数量和分布状态（附着于膜上 vs. 在胞内转运）。通过免疫荧光共定位分析，研究白蛋白和IgG是否与特定囊泡标记物（如caveolae的标记Cav1，clathrin-coated pits的标记Clathrin）共定位。
- FcRn受体功能研究：这是本研究的核心机制探索部分，包含多角度实验：
- 浓度依赖性实验：测量不同灌注浓度下白蛋白和IgG的渗透性，观察是否出现饱和动力学，以提示受体介导的运输。
- 共定位分析：验证MVNs中FcRn的表达，并分析白蛋白和IgG与FcRn的共定位程度。同时，分析它们与早期内体（Rab5）和溶酶体（LAMP1）标记物的共定位，以探究其胞内去向。
- pH扰动实验：改变管腔侧培养基pH至6.0（增强FcRn与IgG在细胞表面的结合）或使用Bafilomycin A1处理（提高内体pH，破坏FcRn与IgG在内体中的结合），观察对IgG渗透性的影响。
- 基因敲低实验：使用siRNA敲低MVNs内皮细胞中的FcRn表达，并通过流式细胞术验证敲低效率，然后测量对IgG和白蛋白渗透性的影响。
数据统计：Transwell实验进行3次重复。MVNs实验使用来自3次独立生物重复的3个芯片，每个芯片进行3次测量（不同视野的Z-stack）。使用Student’s t检验评估统计学显著性。
主要结果 1. 成功构建生理相关的3D微血管网络模型：MVNs在形态学上成功模拟了体内毛细血管，平均直径约20μm，血管密度和表面积与体内组织（如人脑）相近。更重要的是，MVNs形成了连续的内皮细胞连接（VE-cadherin和ZO-1染色连续），并表达了功能性的带负电荷的糖萼层（厚度约1μm）。这些结构特征是其屏障功能的基础。
MVNs展现出接近体内的低渗透性和高选择性：
- 与Transwell对比：对于所有测试的大分子（葡聚糖、白蛋白、IgG），MVNs测得的渗透系数均比Transwell系统低约两个数量级（~10⁻⁸ cm/s vs. ~10⁻⁶ cm/s），且MVNs的值落在多种动物模型体内测量报告的范围内，而Transwell的值则远高于体内值。
- 尺寸选择性：随着葡聚糖分子量增加，MVNs的渗透性呈指数下降，且下降速度比Transwell系统更快，表明其屏障的尺寸选择性更严格。
- 电荷选择性：带正电荷的葡聚糖在MVNs中的渗透性显著高于中性葡聚糖，而带负电荷的则较低，这与其表面带负电的糖萼层的静电排斥作用一致。这种电荷依赖性在Transwell系统中未观察到。
- 对血管内皮生长因子（VEGF）的反应：用VEGF处理MVNs可诱导内皮细胞连接“松开”（但未形成如Transwell中的间隙），并显著增加IgG和葡聚糖的渗透性，证明该模型能模拟病理状态下的“渗漏”内皮。
证实白蛋白和IgG在MVNs中主要通过跨细胞途径运输：
- 温度敏感性：将温度从37°C降至21°C，白蛋白和IgG的渗透性分别显著下降了约47%和67%，而相似分子量的葡聚糖的渗透性无显著变化。SEM观察证实，低温下附着在细胞膜上的囊泡增多，而胞内转运的囊泡减少。这强烈表明白蛋白和IgG的运输高度依赖于温度敏感的囊泡运输过程（即跨细胞途径），而葡聚糖主要依赖被动扩散（细胞旁途径）。
- 囊泡类型差异：共定位分析显示，白蛋白与caveolae标记物（Cav1）的共定位程度显著高于IgG；而IgG则更多地与clathrin-coated pits标记物共定位。这表明两者可能通过不同的囊泡途径进行跨细胞转运。
揭示FcRn在IgG跨内皮转运中的独特作用：
- 饱和动力学：白蛋白和IgG的渗透性随其灌注浓度升高而非线性下降，符合受体介导的跨细胞运输饱和动力学模型。通过模型拟合，推算出两者具有不同的受体浓度和解离常数，提示可能存在不同的主导受体。
- FcRn表达与定位：MVNs中表达FcRn，且IgG与FcRn的共定位程度高于白蛋白。IgG在早期内体中的定位多于溶酶体，表明白蛋白也存在类似趋势，而葡聚糖则无此差异，这与FcRn介导的胞内循环（防止降解）功能一致。
- 功能扰动实验的意外发现：与在某些上皮细胞中观察到的FcRn促进IgG跨细胞转运不同，本研究在MVNs（人内皮模型）中发现：
- 降低管腔pH（增强结合）反而降低了IgG的渗透性。
- 使用Bafilomycin A1提高内体pH（减弱结合）则增加了IgG的渗透性。
- 敲低FcRn表达同样增加了IgG的渗透性，但对白蛋白渗透性无影响。
- 结论：这些一致的结果表明，在MVNs模拟的人血管内皮中，FcRn并非作为将IgG从管腔主动转运至基底的“运输车”，而是扮演了“回收站”的角色。它通过在内体中结合IgG并将其循环回管腔，从而拮抗了IgG从管腔到基底的净跨细胞转运。这为理解FcRn在内皮细胞中的功能提供了新的视角。
结论与价值 本研究成功开发并验证了一种基于三维自组装人源微血管网络（MVNs）的“芯片上”模型，用于精确测量生物大分子的跨内皮渗透性。该模型在形态、屏障功能和转运机制上均表现出高度的生理相关性，其测得的渗透系数与体内值相符，显著优于传统的二维Transwell模型。
科学价值： 1. 提供了更优的体外研究工具：MVNs模型克服了现有体外模型通透性过高、无法区分转运途径的局限，为研究大分子（尤其是生物制剂）的血管外渗提供了生理相关的定量平台。 2. 阐明了关键转运机制：明确证实了在生理性内皮屏障下，白蛋白和IgG等大蛋白主要通过跨细胞途径转运，且可能涉及不同的囊泡系统。 3. 重新诠释了FcRn在内皮细胞中的作用：获得了与部分传统认知不同的重要发现，即在内皮细胞中，FcRn主要作为IgG的胞内回收受体，限制而非促进其从血管腔向组织的净转运。这一发现对于基于FcRn工程化以延长半衰期或改变组织分布的抗体类药物设计具有重要启示。 4. 展示了模型的应用潜力：该平台可用于研究不同分子特性（大小、电荷、与受体的亲和力等）对渗透性的影响，有望用于候选药物的早期筛选和优化，以改善其组织分布特性。
应用价值：该技术有望在制药工业中用于高通量筛选和优化生物治疗候选分子，预测其在体内的组织分布，从而帮助设计出更具疗效和安全性的药物。同时，它也有助于减少对动物实验的依赖。
研究亮点 1. 模型创新性：利用三维自组装微血管网络，在微流控芯片上成功重建了具有体内相关性屏障功能和复杂微环境（包括细胞-基质、细胞-细胞相互作用）的人内皮模型。 2. 数据生理相关性：首次在体外模型中获得了与体内测量值数量级一致的蛋白质渗透系数，并重现了渗透性的尺寸和电荷选择性。 3. 机制研究深度：通过多角度实验（温度、囊泡分析、受体扰动）清晰区分并量化了细胞旁和跨细胞转运途径，并对FcRn这一重要药物靶点在内皮转运中的作用提出了新颖且证据充分的见解。 4. 方法学严谨性：开发了完整的基于三维成像和图像分析的定量渗透性测量方法，并设置了严格的对照（如内皮单层防止侧向扩散、与Transwell直接对比、多参数验证等）。
其他有价值内容 研究还详细描述了微流控装置的制造工艺、细胞培养的具体条件、图像分析和数据处理的数学公式，为其他研究者复现该模型提供了充分的技术细节。此外，研究对FcRn作用的讨论部分，联系了其在药物设计中的应用前景，将基础研究发现与生物制药的实际需求紧密结合。