研究报告
主要作者及发表信息
本研究由江南大学医学院的吴敏辰（Min-Chen Wu）教授团队主导，第一作者为胡蝶（Die Hu）和汤存多（Cun-Duo Tang）。合作者还包括江南大学生物技术学院、药物科学学院以及南阳师范学院的研究人员。该研究成果于2015年3月3日在线发表于《Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology》期刊（第42卷，第671-680页）。
学术背景与研究目的
本研究属于生物催化（Biocatalysis）领域，聚焦于环氧化物水解酶（Epoxide Hydrolases, EHs, EC 3.3.2.3）的挖掘与应用。环氧化物水解酶是一类广泛存在于微生物、植物和哺乳动物中的酶，能够催化环氧化物水解生成相应的邻位二醇（Vicinal Diols）。这类酶不依赖辅因子，其结构中包含一个保守的α/β水解酶折叠核心拓扑结构和一个由天冬氨酸-谷氨酸/天冬氨酸-组氨酸组成的催化三联体（Catalytic Triad）。在催化过程中，亲核天冬氨酸残基攻击环氧环碳原子形成酶-底物中间体，随后该中间体被组氨酸和谷氨酸/天冬氨酸协同激活的水分子水解。
利用具有对映选择性（Enantioselectivity）的环氧化物水解酶拆分外消旋环氧化物（Racemic Epoxides），可以制备光学纯的环氧化物和邻位二醇，这些手性砌块在合成药物、农用化学品和精细化学品等高附加值生物活性化合物中具有重要价值。特别是外消旋苯基环氧乙烷（Styrene Oxide, SO），其(S)-对映体是合成杀线虫剂、抗癌药物左旋咪唑和抗HIV药物的重要中间体。然而，已知的微生物环氧化物水解酶常因催化活性低和/或对映选择性比率（Enantiomeric Ratio, E值）不高而限制了其工业应用。因此，本研究旨在从宇佐美曲霉（Aspergillus usamii）E001菌株中克隆一个编码新型环氧化物水解酶的基因Aueh2，将其在大肠杆菌中进行异源表达，表征重组酶的酶学性质，并探究其用于拆分外消旋苯基环氧乙烷制备(S)-苯基环氧乙烷的性能及对映选择性机理。
详细研究流程
本研究工作流程主要包括五个核心环节：基因克隆与生物信息学分析、重组表达与纯化、酶学性质表征、外消旋底物拆分应用以及分子对接模拟（Molecular Docking, MD）分析对映选择性机制。
第一，基因克隆与序列分析。研究人员首先从实验室保藏的宇佐美曲霉E001菌株中提取总RNA和基因组DNA。为获取Aueh2基因的全长cDNA序列，他们采用了cDNA末端快速扩增技术（RACE）。通过3‘-RACE和5‘-RACE分别扩增出668 bp和1459 bp的cDNA片段，最终拼接得到全长1559 bp的cDNA序列，包含一个编码395个氨基酸的开放阅读框（ORF）。为获取完整的DNA序列，研究团队开发并使用了一种新型的T型发夹结构介导的PCR技术（T-hairpin structure-mediated PCR, THSM-PCR）。该技术通过五个步骤：Xba I酶切基因组DNA、用rTaq DNA聚合酶在3’端加A尾、制备T型发夹结构接头、连接接头与DNA片段、以及两轮特异性PCR扩增，成功克隆了5‘和3’侧翼DNA片段。最终组装得到全长2481 bp的完整DNA序列，与cDNA比对后发现其含有7个内含子，并确定了启动子区的TATA框。通过生物信息学分析，推导出Aueh2蛋白的一级结构，并预测其催化三联体为Asp191-His369-Glu343，两个参与底物结合和环氧环开环的保守酪氨酸残基为Tyr249和Tyr312。
第二，重组表达与纯化。基于克隆的全长cDNA序列，研究人员设计引物扩增Aueh2的编码区cDNA片段，并将其插入到质粒pET-28a(+)中，构建了重组表达质粒pET-28a(+)-Aueh2。将该质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得了重组工程菌E. coli/pET-28a-Aueh2。在28°C条件下，经0.2 mM IPTG诱导表达8小时后，重组酶（re-AuEH2）的催化活性达到1.44 U/mL，且主要以可溶形式存在。利用重组酶N端融合的His标签，通过镍-次氮基三乙酸（Ni-NTA）亲和层析柱对细胞裂解上清液进行一步纯化，获得了电泳纯的重组酶，纯化倍数为2.4倍，回收率为65.7%。SDS-PAGE分析显示其表观分子量约为44.3 kDa。
第三，酶学性质表征。研究团队使用外消旋苯基环氧乙烷为底物，对纯化的re-AuEH2进行了系统的酶学性质表征。实验测定了pH和温度对酶活性和稳定性的影响，以及金属离子和化学试剂对酶活性的效应。同时，分别以®-SO和(S)-SO为底物，测定了重组酶的动力学参数，包括米氏常数（Km）和最大反应速率（Vmax）。
第四，应用于外消旋苯基环氧乙烷拆分。研究测试了re-AuEH2在不同温度（10°C, 20°C, 35°C）下对外消旋苯基环氧乙烷的拆分效果。利用配备手性色谱柱的气相色谱仪对不同时间点的反应样品进行分析，通过检测底物®-SO和(S)-SO的浓度变化，计算了产物(S)-SO的对映体过量值（Enantiomeric excess, ee）、产率（Yield）以及酶的对映选择性比率（E值）。
第五，分子对接模拟分析。为阐释re-AuEH2偏好®-SO的分子机制，研究人员基于已知的黑曲霉EH晶体结构，利用Modeller 9.9软件同源模建了Aueh2的三维结构。使用AutoDock 4.2软件模拟了Aueh2分别与®-SO和(S)-SO的分子对接，并通过GROMACS 4.5进行优化。通过PyMOL测量了关键原子间的距离，并使用MM-PBSA方法计算了结合自由能（ΔGbind）。
主要研究结果
在基因克隆方面，成功获得了Aueh2的全长cDNA和完整DNA序列，并在GenBank数据库中登记（登录号KF061095）。生物信息学分析表明，Aueh2与来自其他曲霉的环氧化物水解酶序列一致性在56.5%至91.1%之间，含有保守的HGWP基序、GHDIGS亲核基序和GGHFAALE八肽基序，其催化三联体和关键酪氨酸残基的预测结果为理解其功能提供了结构基础。
在表达纯化方面，re-AuEH2在大肠杆菌中成功实现了高效可溶表达，约占大肠杆菌总蛋白的41%。其纯化后的比活力（Specific Activity）高达9.7 U/mg，显著优于来自黑曲霉M200（0.64 U/mg）、放射土壤杆菌AD1（1.04 U/mg）和马铃薯（2.0 U/mg）等报道的环氧化物水解酶，显示出优异的催化潜力。
在酶学性质方面，re-AuEH2的最适pH为7.0，在pH 5.0–7.5范围内高度稳定（残余活力>85%）。最适温度为35°C，在40°C及以下温育1小时仍保留超过90%的活性，其热稳定性优于黑曲霉来源的EH。其活性不受β-巯基乙醇、EDTA及多数金属离子显著影响，但被Hg²⁺、Sn²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺和Zn²⁺强烈抑制。动力学分析显示，re-AuEH2对®-SO的亲和力更高（Km为5.90 mM），催化效率也远高于(S)-SO（Vmax为20.1 U/mg对比3.19 U/mg；kcat为15.5 s⁻¹对比2.36 s⁻¹），Kcat/Km比值（2.77对比0.31）相差约8.9倍，清晰地证明了该酶优先水解®-SO。
在应用拆分方面，实验结果与动力学参数一致。在10°C下反应80分钟，可获得高纯度的(S)-SO（ee值达99.2%），产率为38%，E值高达24.2。随着温度升高至35°C，虽然反应速率加快，但产率（27.5%）和E值（10.3）均显著下降。此E值高于文献中报道的多数用于制备(S)-SO的环氧化物水解酶，表现出了良好的应用前景。
在分子机制方面，通过同源建模成功构建了Aueh2的三维结构，该结构分为核心α/β结构域、盖子结构域和N端曲折结构域。分子对接模拟揭示了re-AuEH2的对映选择性机理：虽然®-SO和(S)-SO与酶的结合自由能相似，但®-SO处于更利于反应的“近攻击构象”（Near Attack Conformation）。具体表现为，亲核残基Asp191的氧原子与®-SO环氧环上未取代碳原子的距离为3.2 Å，处于3.5–4.0 Å的最佳反应范围，而与(S)-SO的距离为4.2 Å；此外，Tyr312与®-SO形成的氢键（3.1 Å）也比与(S)-SO形成的（4.1 Å）更短。这些结构特征从原子层面解释了re-AuEH2偏好水解®-SO的实验结果。
研究结论与价值
本研究成功地从宇佐美曲霉E001中克隆了一个新型环氧化物水解酶基因Aueh2，并实现了其在大肠杆菌中的高效异源表达。所获得的重组酶re-AuEH2展现出高比活力、对®-SO的底物偏好性、较宽的pH稳定性范围和良好的热稳定性，这些优异的酶学特性使其成为制备光学纯环氧化物和邻位二醇的有力候选者。尤其通过分子对接模拟，将酶对底物的对映选择性差异与关键的原子间距离和氢键相互作用联系起来，深入阐明了其偏好®-SO的分子机制。该研究不仅为手性苯基环氧乙烷的生物制备提供了新型高效的催化剂，也为基于结构理性改造环氧化物水解酶以进一步提高其催化性能和对映选择性奠定了坚实的理论基础。研究中自主开发的THSM-PCR技术也为未知DNA侧翼序列的克隆提供了一种有效的新方法。
研究亮点
本研究的主要亮点在于：首先，发现了一个性能优越的新型环氧化物水解酶re-AuEH2，其比活力和对映选择性均处于较高水平。其次，在实验验证的基础上，成功运用分子对接模拟技术，从原子层面精准阐释了酶的对映体识别和偏好性催化机制，实现了实验与计算的相互印证。此外，研究过程中开发并应用了原创的THSM-PCR技术，解决了基因侧翼序列获取的技术问题，方法学上具有创新性。这些成果无论是对于酶资源的开发，还是对于酶催化机理的理解，都具有重要学术价值。