柑橘类黄酮柚皮素（naringenin，NAR）在体外抑制寨卡病毒（Zika virus，ZIKV）感染人细胞的研究发表于 *Scientific Reports*，文章于2019年在线发表，DOI为10.1038/s41598-019-52626-3。该研究由巴西奥斯瓦尔多·克鲁兹基金会卡洛斯·查加斯研究所（Instituto Carlos Chagas/FIOCRUZ-PR）分子病毒学实验室的Pryscilla Fanini Wowk和Juliano Bordignon作为通讯作者，联合圣保罗大学、隆德里纳州立大学等多家巴西研究机构完成。主要作者Allan Henrique Depieri Cataneo和Diogo Kuczera为共同第一作者，研究团队还包括Andrea Cristine Koishi、Camila Zanluca、Guilherme Ferreira Silveira、Claudia Nunes Duarte dos Santos等。

寨卡病毒属于黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属，主要通过伊蚊叮咬传播，也可经性接触、血液及母婴垂直传播。感染通常无症状或仅表现为发热、皮疹、关节痛等轻微症状，但2013年法属波利尼西亚和2015年巴西疫情期间，格林-巴利综合征和先天性小头畸形病例显著增加。2015年12月至2018年3月巴西报告超过23万例寨卡病毒感染，3100余例儿童确诊寨卡相关先天性神经综合征。目前尚无获批疫苗或抗病毒药物用于预防或治疗寨卡病毒感染。黄酮类化合物是广泛存在于水果和蔬菜中的多酚类次生代谢产物，已报道对HIV-1、单纯疱疹病毒、流感病毒、登革病毒和黄热病毒具有抗病毒活性。柚皮素是一种天然黄酮苷元，广泛分布于柑橘类水果、番茄、樱桃、葡萄柚和可可中，具有抗炎和镇痛作用。近期研究显示柚皮素在体外具有抗登革病毒活性，而寨卡病毒与登革病毒同属黄病毒科，这一相似性促使研究团队测试柚皮素对寨卡病毒的体外抑制作用。

研究首先通过膜联蛋白V（annexin V）和7-AAD双染法测定柚皮素对A549人肺上皮细胞的细胞毒性。结果显示柚皮素在500至2000 μM浓度下对A549细胞具有毒性，500 μM时约10%细胞发生凋亡。以双阴性细胞（annexin V⁻/7-AAD⁻）计算半数细胞毒性浓度（CC₅₀）为693.6 μM。尽管250 μM未显示明显毒性，但为避免残余毒性，将125 μM确定为最大无毒浓度（maximal non-toxic concentration，MNTC）。高内涵成像系统（Operetta）细胞核计数进一步证实125 μM柚皮素不减少细胞数量。随后在A549细胞中评估柚皮素对寨卡病毒巴西临床分离株ZV BR 2015/15261的抗病毒活性。细胞以0.1感染复数（multiplicity of infection，MOI）感染90分钟后去除接种物，再用不同浓度柚皮素（15.6、31.25、62.5和125 μM）处理48小时。流式细胞术检测显示柚皮素以浓度依赖性方式降低4G2阳性感染细胞比例；培养上清中的病毒滴度也相应下降。值得注意的是，干扰素α-2a（IFN-α 2a）虽能减少感染细胞数量，但培养上清中活病毒颗粒的减少程度不及柚皮素处理组。柚皮素的半数抑制浓度（IC₅₀）和90%抑制浓度（IC₉₀）分别为58.79 μM和154.37 μM，选择性指数（selectivity index，SI）为11.79。免疫荧光高内涵成像和RT-qPCR进一步证实柚皮素减少感染细胞数量并抑制病毒RNA复制。病毒灭活实验显示柚皮素对病毒颗粒无直接杀病毒作用，也不影响细胞自发荧光。

为验证柚皮素抗病毒活性的毒株谱系依赖性，研究团队测试了另外四株寨卡病毒，包括三株亚洲谱系（ZV BR 2016/16288、ZV BR 2015/15098、ZIKV PE243）和一株非洲谱系（ZIKV MR766）。流式细胞术和灶形成免疫检测（foci-forming immunodetection assay，FFUC6/36）结果表明，柚皮素对亚洲谱系和非洲谱系寨卡病毒感染均有抑制作用，但对亚洲谱系的抑制效果更强（约降低4倍感染），对非洲谱系约降低2倍。加药时间实验显示，柚皮素在感染同时及感染后处理均能显著降低感染细胞比例和病毒滴度，而仅在感染前预处理1.5小时无明显效果；延长预处理至18小时则观察到轻微抗病毒作用。进一步延迟加药实验表明，感染后0、1、2、4、6小时添加柚皮素均能有效降低感染细胞和病毒滴度，即便在感染后24小时添加，仍能观察到病毒滴度的下降，尽管效果弱于早期处理。这些结果提示柚皮素可能作用于病毒复制、成熟或组装阶段。

为了探究柚皮素的潜在分子靶点，研究团队采用AutoDock Vina进行分子对接分析。受体结构为寨卡病毒NS2B-NS3蛋白酶晶体结构（PDB ID 5GPI），对接搜索体积聚焦于先前在登革病毒蛋白酶中鉴定的变构腔。对接结果显示柚皮素能够以与已知非竞争性抑制剂杨梅素（myricetin）和芹菜素（apigenin）相似的方式与寨卡病毒蛋白酶相互作用，提示柚皮素可能通过非竞争性机制抑制NS2B-NS3蛋白酶活性，但尚需实验验证。此外，研究还在多种细胞系中评估了柚皮素的抗寨卡病毒活性。结果显示柚皮素能降低人胶质母细胞瘤细胞系（A172）和人肝癌细胞系（Huh7.5）的寨卡病毒感染，但在人胚胎干细胞系（NKX2-5eGFP/wHESC）中未观察到抑制效果，这可能与不同细胞系对黄酮类化合物的吸收和代谢差异有关。鉴于树突状细胞在免疫应答中的关键作用及其对寨卡病毒的高度易感性，研究团队进一步在原代人单核细胞来源树突状细胞（human monocyte-derived dendritic cells，hmDDCs）中验证柚皮素的抗病毒作用。来自五名健康供体的hmDDCs以MOI 10感染寨卡病毒并用125 μM柚皮素处理24小时。流式细胞术检测显示柚皮素显著降低hmDDCs中寨卡病毒感染细胞（CD14⁻/CD11c⁺/4G2⁺）的比例，培养上清中的病毒滴度也明显下降。125 μM柚皮素对hmDDCs无毒性。

该研究通过多种实验技术证明柚皮素在体外具有抗寨卡病毒活性，其作用不局限于特定病毒谱系，且在感染后24小时添加仍保持一定效果。分子对接结果提示NS2B-NS3蛋白酶可能是柚皮素的分子靶点。该研究为柚皮素作为抗寨卡病毒候选药物提供了实验依据，其抗炎镇痛特性可能为寨卡病毒感染患者带来额外治疗优势。研究亮点在于：首次系统证明柑橘类黄酮柚皮素对亚洲和非洲谱系寨卡病毒临床分离株的体外抑制作用；通过加药时间实验将作用阶段定位于病毒复制后期；结合分子对接提出NS2B-NS3蛋白酶的非竞争性抑制机制；并在原代人树突状细胞中验证了抗病毒效果，增强了临床相关性。然而，该研究仍局限于体外实验，柚皮素在体内的抗寨卡病毒效果、药代动力学特性及安全性尚需进一步动物实验和临床研究加以验证。