本研究由赵伟（Wei Zhao）、宋康平（Kangping Song）、杨芬（Fen Yang）、肖慧（Hui Xiao）、刘燕（Yan Liu）、余雅纯（Yachun Yu）及王特（Te Wang，通讯作者）共同完成，其中赵伟与宋康平为共同第一作者。研究团队主要来自南华大学衡阳医学院附属长沙市中心医院神经内科（Department of Neurology, The Affiliated Changsha Central Hospital, Hengyang Medical School, University of South China）及科教部（Department of Science and Education）。该研究作为原创性研究论文（Original Research）于2026年4月28日在线发表于国际学术期刊《Frontiers in Immunology》（Front. Immunol. 17:1766326），DOI为10.3389/fimmu.2026.1766326。该期刊为开放获取（Open Access）期刊，文章采用知识共享署名许可协议（CC BY）发布。
卒中是因缺血或出血引起的急性神经系统损伤，其病理机制涉及广泛的病理过程。卒中后认知障碍（Post-stroke Cognitive Impairment, PSCI）是卒中患者常见的长期并发症，约三分之一的卒中患者会发展为PSCI，严重影响其生活质量和生存时间。神经炎症是卒中后脑损伤的重要病理机制之一，涉及小胶质细胞、星形胶质细胞、内皮细胞和白细胞等多种细胞的激活，并导致肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6）等促炎细胞因子的释放。持续性神经炎症可破坏海马等认知相关脑区的神经元连接、抑制神经发生，最终导致认知功能下降。然而，连接“神经炎症”与“PSCI”之间的明确分子通路尚不清楚。
microRNA（miRNA）是一类由20至25个核苷酸组成的非编码RNA，可通过与靶基因mRNA的3’非翻译区（3’UTR）结合来调控靶基因的转录和翻译。已有研究表明，miR-511-3p在肿瘤、心血管疾病和神经系统疾病中发挥重要作用；在阿尔茨海默病（AD）细胞模型中，miR-511-3p通过调节神经炎症因子水平参与疾病发展；在大脑中动脉闭塞（MCAO）模型中，miR-511-3p的下调与神经功能障碍和炎症加重相关。此外，miR-511-3p可靶向AKT3并抑制其活性，进而影响细胞增殖、凋亡和迁移。AKT3是PI3K/AKT信号通路的核心成员，在神经炎症中具有重要作用；AKT3激活可能促进泛素特异性蛋白酶8（USP8）的去泛素化，影响NF-κB的激活。USP8作为一种关键的去泛素化酶，在神经炎症和神经损伤中具有重要调控作用，可调节小胶质细胞活化及NF-κB和NLRP3炎症小体信号通路。然而，miR-511-3p的调控作用与AKT3/USP8信号通路在“神经炎症—PSCI”中的关联尚未被系统研究。本研究旨在探索miR-511-3p表达变化在PSCI中的作用，确定其是否通过介导AKT3/USP8信号通路的失衡来调控卒中后神经炎症反应，并最终验证“miR-511-3p-AKT3/USP8信号失衡”作为“神经炎症与PSCI之间的分子桥梁”的科学假说。
本研究采用“生物信息学预测—细胞模型验证—临床样本分析”的多层次研究策略，共包含以下几个核心实验环节。
1. 研究对象与临床样本采集。 研究共纳入118例卒中患者和80例健康对照者，所有受试者均来自南华大学衡阳医学院附属长沙市中心医院。纳入标准为：患者符合急性卒中诊断标准且临床记录完整；排除有卒中病史、严重心脏病、严重感染性疾病、夹层、肝肾疾病或恶性肿瘤的病例。研究样本量基于双样本t检验公式（α=0.05，1-β=0.8，中等效应量）和logistic回归的事件每变量（EPV）规则（EPV≥10）进行估算，最终纳入的样本量满足统计学检验效能要求。所有参与者均采集静脉血，离心后于-80°C保存备用。本研究经南华大学衡阳医学院附属长沙市中心医院伦理委员会批准，每例参与者均签署书面知情同意书。
2. 认知功能评估与分组。 采用蒙特利尔认知评估量表（Montreal Cognitive Assessment, MoCA）在入院时和卒中诊断后6个月（PSCI诊断的关键时间点）评估认知功能。根据MoCA评分（截断值为22分），卒中患者被分为PSCI组（MoCA≤22分，n=66）和卒中后认知正常（Post-stroke Cognitive Normal, PSCN）组（MoCA>22分，n=52）。MoCA评估严格按照参考文献（20）中描述的标准化方案执行，以保证评估过程的一致性。
3. 细胞培养与氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型构建。 使用小鼠小胶质细胞系BV2细胞（Procell，中国，CL-0697），复苏后接种于六孔板，加入含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基，在37°C、5% CO2恒温培养箱中培养24小时，取对数生长期细胞用于实验。OGD/R实验在接种后24小时进行：移除原培养基，用无糖DMEM洗涤BV2细胞数次，然后将其置于缺氧培养箱（1% O2，94% N2，5% CO2）中培养6小时；之后移除无糖DMEM，换为完全培养基继续培养24小时以模拟再灌注。对照组细胞除不暴露于OGD外，其余处理相同。随后根据实验需要对OGD/R刺激的BV2细胞模型进行转染处理。miR-511-3p模拟物（mimic）和阴性对照（mimic NC）由RiboBio（中国广州）合成；将AKT3和USP8基因亚克隆至pcDNA3.1载体（Invitrogen，美国）中，构建pcDNA3.1-AKT3和pcDNA3.1-USP8过表达载体。使用Lipofectamine 2000将质粒和miR-511-3p mimic/mimic NC（终浓度50 nM）转染至细胞中，转染后的细胞在37°C培养48小时后用于后续实验。
4. 双荧光素酶报告基因实验。 研究使用StarBase数据库（https://starbase.sysu.edu.cn/）预测miR-511-3p与AKT3的结合位点。将含有miR-511-3p结合位点的AKT3序列亚克隆至双荧光素酶报告质粒中构建野生型重组质粒AKT3-WT，同时将结合位点的突变序列插入质粒中构建突变型质粒AKT3-Mut。BV2细胞接种于24孔板，将上述重组质粒与miR-511-3p mimic/mimic NC或miR-511-3p抑制剂/inhibitor NC混合，在Lipofectamine 3000介导下转染，48小时后评估相对荧光素酶活性。
5. 炎症反应评估。 采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清和细胞上清中促炎细胞因子的浓度，包括IL-1β（Thermo Fisher Scientific，货号29-8012-65）、IL-6（货号29-8061-65）和TNF-α（货号29-831-65）。操作步骤为：取100 μL样品加入ELISA板，与抗体孵育60分钟后洗涤，加入100 μL HRP工作液孵育30分钟，加入底物避光孵育15分钟，最后加入终止液，用Multiskan酶标仪测定450 nm波长处的吸光度。
6. 逆转录-定量聚合酶链反应（RT-qPCR）。 使用RNA提取试剂（Invitrogen，中国上海）提取总RNA，用NanoDrop 2000分光光度计评估RNA质量。使用逆转录试剂盒（Takara，日本）将RNA反转录为cDNA，使用SYBR Green I Master Mix试剂盒和ABI 7500实时荧光定量PCR系统（Applied Biosystems，美国）进行qPCR。引物序列由Sangon（中国上海）合成。AKT3和USP8以内参GAPDH进行标准化，miR-511-3p以U6进行标准化，采用2^-ΔΔCT法计算相对表达水平。
7. 统计学分析。 采用SPSS 27.0、GraphPad Prism 9.0和R软件（版本4.2.1）进行统计分析。基线临床和人口学特征中，连续变量采用单因素方差分析（ANOVA），分类变量采用卡方检验。两组间基因表达差异采用独立样本t检验，多组间差异采用单因素ANOVA。Pearson相关系数用于评估miR-511-3p、AKT3、USP8与炎症细胞因子表达在神经炎症中的相关性。采用logistic回归分析探讨miR-511-3p、AKT3、USP8与PSCI发生之间的关联；多因素logistic回归调整了年龄、性别、吸烟状况、饮酒状况、糖尿病和高血压等协变量。采用受试者工作特征曲线（ROC）评估miR-511-3p和USP8区分PSCI和PSCN的诊断效能，计算曲线下面积（AUC）、截断值、灵敏度、特异度，并采用校准曲线、Hosmer-Lemeshow检验和Bootstrap内部验证法进一步评估模型性能。P<0.05被认为具有统计学意义。
1. AKT3是miR-511-3p的直接靶基因。 StarBase数据库预测结果显示，AKT3的3’UTR中含有与miR-511-3p互补的序列。双荧光素酶报告基因实验证实，在BV2细胞中，miR-511-3p过表达显著抑制了野生型AKT3-WT组的相对荧光素酶活性，而miR-511-3p表达降低则产生了相反的效果（P<0.01）；然而，miR-511-3p mimic或inhibitor转染对AKT3-Mut转染细胞的荧光素酶活性无影响。这些结果证明AKT3是miR-511-3p的直接靶基因。
2. miR-511-3p在OGD/R细胞模型中对AKT3/USP8的调控作用。 OGD/R刺激建立的神经炎症细胞模型中，miR-511-3p和USP8的表达显著受抑，而AKT3表达显著升高（P<0.01）。转染效率验证显示，miR-511-3p mimic显著上调miR-511-3p表达（P<0.001）。miR-511-3p mimic在细胞模型中抑制了AKT3的表达（P<0.01），而共转染pcDNA3.1-AKT3可逆转这种抑制作用。此外，pcDNA3.1-AKT3抑制了USP8的表达，但在pcDNA3.1-AKT3细胞中转染miR-511-3p mimic则能显著恢复USP8的水平（P<0.001）。这些结果表明，miR-511-3p可通过靶向AKT3来调控USP8的表达，三者构成了一个调控级联。
3. miR-511-3p/AKT3/USP8对BV2细胞炎症反应的调控。 OGD/R刺激显著增加了IL-1β、IL-6和TNF-α的释放（P<0.001）。上调miR-511-3p或USP8的表达均可显著抑制炎症细胞因子的升高；而AKT3过表达则促进了炎症细胞因子的释放。值得注意的是，miR-511-3p过表达所介导的炎症抑制作用可被AKT3过表达所消除（P<0.05）。这一“拯救实验”结果进一步证实了AKT3/USP8信号轴在miR-511-3p调控神经炎症过程中的中介作用。
4. 临床样本中miR-511-3p、AKT3和USP8的表达特征。 基线临床特征分析显示，健康对照组、PSCI组和PSCN组在年龄、BMI、性别、吸烟和饮酒状况方面无显著差异，组间基线可比性良好；PSCI组的糖尿病和高血压比例显著高于健康对照组。与健康个体相比，卒中患者血清中miR-511-3p和USP8的相对表达显著降低，而AKT3表达显著升高（P<0.001）。在PSCN和PSCI组中，三者的表达趋势一致；与PSCN组相比，PSCI患者中miR-511-3p和USP8表达进一步降低，AKT3表达进一步升高（P<0.001）。相关性分析显示，miR-511-3p（r=0.709）和USP8（r=0.741）与MoCA评分呈显著正相关，而AKT3与MoCA评分呈显著负相关（r=-0.743，P<0.001），提示这些分子与卒中后认知功能密切相关。
5. miR-511-3p、AKT3、USP8与炎症细胞因子的相关性。 Pearson相关分析显示，PSCI患者血清中miR-511-3p的表达与IL-1β（r=-0.669）、IL-6（r=-0.716）和TNF-α（r=-0.661）均呈显著负相关；AKT3的表达与三种炎症因子呈显著正相关（r分别为0.665、0.725和0.637）；USP8的表达与三种炎症因子呈显著负相关（r分别为-0.678、-0.767和-0.683），所有相关性的P值均小于0.001。
6. PSCI风险因素的logistic回归分析。 单因素logistic回归分析显示，miR-511-3p和USP8低表达及AKT3高表达与PSCI风险相关（P<0.05）。在校正年龄、性别、吸烟、饮酒、糖尿病和高血压等混杂因素后，多因素logistic回归分析表明，miR-511-3p低表达（OR=0.028，95% CI：0.006-0.125，P<0.001）和USP8低表达（OR=0.028，95% CI：0.006-0.134，P<0.001）仍为PSCI的独立风险因素，而AKT3的影响不再显著。年龄、性别、吸烟、饮酒、糖尿病和高血压在单因素和多因素分析中均未显示与PSCI风险显著相关。
7. PSCI预测模型的准确性评估与验证。 ROC曲线分析显示，miR-511-3p单独预测PSCI的AUC为0.857，USP8为0.830，两者均表现出良好的诊断性能。值得注意的是，两者联合模型的AUC达到0.903，优于任一单独指标，显示了更高的预测准确性。校准曲线显示联合模型的预测概率与实际观察结局之间有良好的一致性；Hosmer-Lemeshow检验的χ²值为13.56，P值为0.094，表明模型校准满意。经过1000次Bootstrap重抽样验证，联合模型的预测准确率为88.2%（95% CI：82.2%–93.2%），显示了良好的判别能力、校准度和内部稳定性。
本研究的核心结论是：miR-511-3p通过靶向AKT3来调控USP8的表达，进而影响神经炎症反应，并参与PSCI的发生和发展过程。具体而言，miR-511-3p表达降低削弱了对AKT3的抑制，导致AKT3表达升高和USP8表达降低，从而促进卒中后神经炎症的持续和放大，最终推动认知障碍的发生。更重要的是，miR-511-3p和USP8有望成为PSCI的生物标志物和治疗靶点。
本研究的科学价值在于：首次系统揭示了miR-511-3p/AKT3/USP8调控轴作为连接神经炎症与PSCI的“分子桥梁”作用，填补了该领域分子机制研究的空白。从方法学角度看，研究采用“生物信息学预测—分子靶向验证—细胞功能实验—临床样本验证”的完整证据链，从分子、细胞和临床三个层面系统验证了科学假说，体现了转化医学研究的设计理念。从应用价值看，miR-511-3p和USP8联合模型对PSCI具有较高的诊断效能（AUC=0.903），可为PSCI的早期风险识别和诊断提供潜在的血清生物标志物；同时，该信号轴也为开发针对PSCI的靶向治疗策略提供了理论依据。
本研究具有以下突出亮点：其一，提出了“miR-511-3p-AKT3/USP8信号失衡作为神经炎症与PSCI之间分子桥梁”的原创性科学假说，并通过多层次的实验证据加以验证；其二，在细胞模型中采用“过表达miR-511-3p+过表达AKT3”的双重干预“拯救实验”设计，有力证明了AKT3/USP8在miR-511-3p调控炎症中的中介角色；其三，将细胞分子机制研究与临床流行病学分析相结合，不仅阐明了信号通路的作用，还通过logistic回归和ROC分析验证了该通路的临床相关性和诊断价值；其四，构建了miR-511-3p与USP8的联合诊断模型，AUC达到0.903，并通过Bootstrap内部验证证明了模型的稳定性，具有较好的临床转化前景。